PLGA攜三七皂苷Rb1微球的制備及實驗條件優化研究

楊丹 姜嵐 朱梅 陳洪艷

【摘要】 目的：使用聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）攜帶包載三七皂苷Rb1制備納米微球并優化實驗條件，尋求包封率及平均粒徑的最優制備條件。方法：制備納米微球使用復乳-溶劑揮發法，使用高效液相色譜儀測定包封率，激光粒度分析儀測定平均粒徑。使用SPSS 13.0統計學軟件，對影響包封率及平均粒徑的因素分別進行五因素四水平正交實驗，分析包封率及粒徑制備的最優條件。結果：PLGA濃度10 mg/mL，O︰W1為10︰3，W2︰W1/O為2︰1，第1次超聲乳化時間10 s，第2次超聲乳化時間90 s的條件下制備的微球包封率最佳。對于粒徑來說，每個因素最佳的水平分別為PLGA濃度20 mg/mL，O︰W1為1︰5，W2︰W1/O為2︰1，第1次超聲乳化時間10 s，第2次超聲乳化時間120 s。結論：高分子有機化合物PLGA可作為為外殼材料包被攜帶三七皂苷Rb1，通過實驗優化可獲得其包封率及粒徑制備的最優條件。

【關鍵詞】 聚乳酸-羥基乙酸共聚物 三七皂苷Rb1 復乳-溶劑揮發法 包封率 粒徑

Preparation of PLGA Loaded Panax Notoginseng Saponin Rb1 Nanoparticles and Optimization of Experimental Conditions/YANG Dan， JIANG Lan， ZHU Mei， CHEN Hongyan. //Medical Innovation of China， 2020， 17（03）： -154

[Abstract] Objective： To prepare nanospheres of panax notoginseng saponin Rb1 with PLGA and optimize the experimental conditions， and to find the optimal preparation conditions of encapsulation rateand average particle size. Method： PLGA loaded panax notoginseng saponin Rb1 nanoparticles were prepared by double emulsion solvent evaporation method. The encapsulation rate was determined by high performance liquid chromatograph and the average particle size was determined by laser particle size analyzer. Five factors and four levels of orthogonal experiments were carried out on the factors affecting the encapsulation rate and the average particle size by SPSS 13.0 statistical software. The optimal conditions of encapsulation rate and particle size preparation were analyzed. Result： When PLGA concentration was 10 mg/mL， O︰W1 was 10︰3， W2︰W1/O was 2︰1， the first time of phacoemulsification was 10 s， and the second time of phacoemulsification was 90 s， the encapsulation efficiency of microspheres was the best. PLGA concentration was 20 mg/mL， O︰W1 was 1︰5， W2︰W1/O was 2︰1， the first time of phacoemulsification was 10 s， the second time of phacoemulsification was 120 s for the best preparation factor of particle size. Conclusion： The polymeric organic compound PLGA can be used as the shell material to carry panax notoginseng saponin Rb1. The optimal conditions of encapsulation rate and particle size preparation can be obtained by experimental optimization.

[Key words] PLGA Panax notoginseng saponin Rb1 Double emulsion solvent evaporation method Encapsulation rate Particle size

First-authors address： Faculty of Chemistry Biology and Environment， Yuxi Normal University， Yuxi 653100， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.03.038

三七皂苷Rb1為三七的單體皂苷成分，具有活血化瘀、消腫、定痛的作用，可抑制炎性細胞趨化與增殖，降低炎性介質的釋放[1-2]。研究顯示Rb1口服后的腸壁吸收機制為單純被動擴散，在吸收過程中，受胃酸性環境、大腸菌叢酶的降解及肝首關消除的影響，其生物利用度降低，并且腸道黏膜的透過性低是常規口服制劑生物利用度低的主要因素[3-4]。因此穩定并且高生物利用度的Rb1口服制劑亟待研究[5-6]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）是一種具備可降解功能的高分子有機化合物，在人體內最終降解產物為二氧化碳和水，具良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能[7-8]，被廣泛應用于制藥、醫用工程材料和現代化工業領域[9-11]，國內外有很多學者們研究使用PLGA作為殼載體來包埋親水性藥物制作納米微球[10-16]。本研究使用PLGA作為載體材料攜帶三七皂苷Rb1，以包封率及平均粒徑為指標，尋求最優制備條件。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 PLGA（分子量，LA︰GA=50︰50，

Aladdin industrial Corporation）/三七皂苷Rb1（上海源葉生物科技有限公司）、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA，Sigma-Aldrich Corporation）、二氯甲烷。超聲細胞破碎儀（SCIENTZ-IID，寧波新芝生物科技股份有限公司）、高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity）、Hypersil GOLD液相色譜柱（250×4.6 mm×5 μm，Thermoscientific）、激光粒度分析儀（英國馬爾文）、磁力攪拌器（溫州標諾儀器有限公司，78-1）、低溫冷凍離心機（Allegra? X-15R）、超純水儀（UPT-I-5/10/20T，西安優普儀器設備有限公司）、電子天平（Precisa ES225SM-DR）。

1.2 微泡的制備方法 使用復乳溶劑法制備以PLGA為載體的攜三七皂苷Rb1納米粒微泡。精密稱取PLGA并溶于二氯甲烷中，制成PLGA-二氯甲烷溶液（油相O）;稱取一定質量的三七皂苷Rb1并制成相應濃度的水溶液作為內水相（W1）;配置1% PVA水溶液為外水相（W2）。混合W1相與O相，將混合乳放入超聲波細胞破碎以行第1次超聲乳化（300 W，T1），制得初乳（W1/O），將初乳快速加入外水相中，再次置入超聲波細胞破碎儀進行第2次超聲乳化（300 W，T2），即可得到復乳。將得到的復乳至于室溫下攪拌4 h，待有機溶劑充分揮發，得到三七皂苷Rb1-PLGA混懸液。將上述液體分裝入離心管內離心（5 min，4 000 r/min），收集上清，蒸餾水洗滌3次并離心后收集全部上清。洗滌后的混懸液沉淀干燥后既得干粉，將其置于4 ℃冰箱中保存、備用。使用馬爾文激光粒度儀測量平均粒徑。前期的預實驗單因素分析中篩選出在制備過程中對微球包封率及粒徑有影響的五種因素，分別是X1（PLGA濃度，mg/mL）、X2（O相體積與W1相體積比）、X3（外水相W2與初乳W1/O體積比）、X4（第1次超聲乳化時間，T1）、X5（第2次超聲乳化時間，T2）;每個因素選4個水平，按L16（45）正交表安排實驗，水平重復實驗3次。見表1。

1.3 高效液相色譜儀三七皂苷Rb1含量測定 A相為乙腈，B相為水，按表2進行梯度洗脫;檢測波長203 nm;進樣量20 μL;流速1.0 mL/min。

1.4 三七皂苷Rb1標準曲線的制備 分別稱取一定質量三七皂苷Rb1，配制不同濃度三七皂苷Rb1溶液，按照前述1.3下色譜條件得到的結果，以峰面積（A）對質量濃度（ρ）進行線性回歸，得到Rb1標準曲線：A=2.543 6ρ-29.556（r=0.997 6）。

1.5 包封率的測定 取1.2中洗滌離心所收集的所有上清，據1.3下色譜條件進行高效液相測定，并根據1.4得到的標準曲線，可得到游離藥物量（cfree），按以下公式計算包封率（entrapment efficiency，EE%）=（ctotal-cfree/ctotal）×100%。

1.6 統計學處理 使用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，采用正交實驗設計、方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

以三七皂苷Rb1-PLGA微球的包封率及平均粒徑為指標，結果見表3～6。影響包封率和平均粒徑的因素，五個因素都有統計學意義（P<0.001）。對包封率的影響依次為X2>X3>X5>X4>X1。如果要達到最優包封率，五個因素的最佳選擇水平為：PLGA濃度為10 mg/mL，O︰W1為10︰3，W2︰W1/O為

2︰1，T1為10 s，T2為90 s;而平均粒徑的影響次序依次為X1>X5>X2>X4>X3。對于粒徑來說，每個因素最佳的水平分別為PLGA濃度20 mg/mL，O︰W1為1︰5，W2︰W1/O為2︰1，T1為10 s，T2為120 s。

*決定系數=0.995（校正決定系數=0.993）。據Ⅲ型平方和（Type Ⅲ Sum of Squares）大小，可得出對于包封率的影響，五個因素次序依次為X2>X3>X5>X4>X1。

*決定系數=0.983（校正決定系數=0.976）;據Ⅲ型平方和的大小，可得出對于包封率的影響，五個因素次序依次為X1>X5>X2>X4>X3。

3 討論

因為PLGA是一種可降解的功能高分子有機化合物，具良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應用于制藥、醫用工程材料和現代化工業領域[9-11]，國內外有很多學者們研究使用PLGA作為殼載體來包埋親水性藥物制作納米微球[10-16]。因此本實驗構建的納米粒由PLGA為成膜材料，由于三七皂苷Rb1是水溶性，因此選取了適合水溶性藥物的復乳-溶劑揮發法[17-18]。筆者在外水相中加入了乳化劑（1% PVA），其作用是使有機相在水相中分散成細小液滴，從而保證了足夠的表面活性劑分子覆蓋有機相與外部水相界面，提高液滴的聚結保護作用[14]。以包封率和平均粒徑作為指標進行優化制備工藝。正交實驗結果顯示，PLGA濃度、O︰W1、W2︰W1/O、T1、T2對包封率及平均粒徑均有影響。對于包封率來說，最佳PLGA濃度為10 mg/mL（X1水平2），可能因為當PLGA濃度過低時（5 mg/mL，X1水平1），體系中的PLGA不足以完全包封Rb1，而當PLGA濃度過高時（20、40 mg/mL，X1水平3、4），W1相內的Rb1濃度不變，但此時PLGA相對過剩，反而不能有效提高包封率;油相與內水相體積比增大，在一定范圍內包封率上升，但當上升至一定程度時反而包封率下降，最佳的O︰W1為10︰3，這與文獻[19]報道相符。而隨著W2︰W1/O的增加，包封率下降，并且T1為10 s，T2為90 s時包封率達到最高。對于納米粒微球粒徑來說，隨PLGA濃度的增加，平均粒徑逐漸減小，這與文獻[20]報道的相符，而隨著W2︰W1/O增大，平均粒徑也增大。

綜上所述，使用復乳-溶劑揮發法，PLGA為載體可成功制備三七皂苷Rb1微球，優化實驗條件為：當PLGA濃度10 mg/mL，O︰W1為10︰3，

W2︰W1/O為2︰1，T1為10 s，T2為90 s的條件下制備的微球包封率最佳。如果要獲得最小粒徑，各因素分別為PLGA濃度20 mg/mL，O︰W1為1︰5，W2︰W1/O為2︰1，T1為10 s，T2為120 s。

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（收稿日期：2019-07-09） （本文編輯：董悅）