逆相蒸發法結合響應面優化抗耐藥結核菌藥物利奈唑胺脂質體處方工藝研究

佟雷 劉金麗 劉世娟

[摘要] 目的 通過逆相蒸發法制備抗結核藥物利奈唑胺脂質體，并利用響應面法優化其制備工藝和處方組成。 方法 以包封率為主要指標進行單因素試驗，以Box-Behnken響應面分析法優化其制備工藝。并將最優工藝下制得的利奈唑胺脂質體于倒置熒光顯微鏡下觀察其形態。 結果 通過逆相蒸發法制備利奈唑胺脂質體的包封率較高;最佳制備工藝：膽固醇-卵磷脂質量比為1：2.45，緩沖液pH值為6.65，超聲時間為3.2 min，旋轉蒸發儀轉速為50 r。 結論 逆相蒸發法的制備工藝簡單，重現性好，所得包封率高。

[關鍵詞] 利奈唑胺脂質體;逆相蒸發法;包封率;Box-Behnken響應面分析法

[Abstract] Objective To prepare antituberculous drug linezolid liposome using the reverse-phase evaporation method， and optimize its preparation process and prescription composition using the response surface method. Methods Single-factor experiment was performed with the entrapment rate as key indicators， and Box-Behnken response surface analysis was used to optimize the preparation process. The linezolid liposome prepared using the optimal preparation process was observed for morphology by inverted fluorescent microscope. Results It was found that the entrapment rate of linezolid liposome prepared using the reverse-phase evaporation method was relatively high; under the optimal preparation process， the mass ratio of cholesterol to lecithin was 1：2.45， the pH value of the buffer solution was 6.65， the ultrasonic time was 3.2 min， and the rotation speed of the rotary evaporator was 50 r. Conclusion The reverse-phase evaporation method has the advantages of simple preparation process， good reproducibility and high entrapment rate.

[Key words] Linezolid liposome; Reverse-phase evaporation method; Entrapment rate; Box-Behnken response surface analysis

結核病是危害性較高的一種疾病，隨著藥學的快速發展，多種抗結核藥物不斷被研發且在臨床上得到廣泛應用。但抗結核藥物往往會產生毒副作用，因此如何減輕抗結核藥物的毒副作用成了新的研究熱點。利奈唑胺為人工合成的惡唑烷酮類抗菌藥，可抗多重耐藥，利奈唑胺為水溶性藥物，通常為片劑，患者口服后常會產生腹瀉、嘔吐等不良反應，其被吸收入血后不易到達病灶而且血藥濃度超過一定濃度還會產生嚴重的毒副作用，因此如何將其有效成分安全高效地送至靶器官是一個極有意義的研究方向。脂質體的靶向性、兩親性、緩釋性等特性使其成為一種理想的藥物載體，因此本實驗欲通過制備利奈唑胺脂質體來實現利奈唑胺的肺部直接給藥[1-3]。

1 材料與儀器

紫外分光光度計（UV-6000PC），鄭州寶京科技有限公司;旋轉蒸發儀（QA-205B），濟寧瑞德儀器設備有限公司;LS13320型激光粒度分析儀（江蘇榮華儀器制造有限公司）;倒置熒光顯微鏡（U-LH100HG），OLYMPUS CORPORATION;利奈唑胺原料藥（P09572），上海泰坦科技有限公司;卵磷脂（20180122），陜西澄明科技有限公司;膽固醇（20180228），江蘇百得科技有限公司;磷脂膜熒光劑（20190310），SIGMAALDRICH。

2 方法與結果

2.1 最大吸收波長的選擇

50 mL容量瓶中加入1 mg利奈唑胺，以 pH值為6.5的緩沖液定容，得20 μg/mL藥物溶液，紫外分光光度法在200～400 nm范圍內每隔10 nm測定吸光度，考察最大吸收波長并繪制曲線。移取空白脂質體混懸液2 mL至50 mL容量瓶中，同法測定。最終確定利奈唑胺最大吸收波長為289 nm，空白脂質體在此波長處無干擾。見圖1、2。

2.2 利奈唑胺的含量測定

標準曲線的建立及方法學考察：10 mg利奈唑胺置50mL容量瓶中定容，得溶液濃度為200 μg/mL。移取0.125 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL置25 mL容量瓶中定容，以PBS溶液為空白對照，得到標準曲線A=0.01C+0.0516，R2=0.9998。線性范圍為1～24 μg/mL，考察其精密度RSD為0.32%，平均回收率為99.7%，24 h內穩定性0.15%，均低于2%，符合制備要求。

2.3包封率的測定

（1）游離藥物量的測定：取利奈唑胺脂質體混懸液置于離心管中，2500 r/min離心20 min，取上清液2 mL于25 mL容量瓶中，緩沖液定容，測定吸光度，然后計算游離藥物濃度。

（2）總藥量的測定：取等量的利奈唑胺脂質體加入甲醇破乳，充分振搖后于2500 r/min下離心20 min，取上清液2 mL于25 mL容量瓶中，緩沖液定容，測定吸光度，然后計算總的藥物濃度[4-5]。

（3）計算包封率的公式：包封率=（C總-C游離）/C總×100%。

2.4 逆相蒸發法制備利奈唑胺脂質體

精密稱取卵磷脂100 mg和膽固醇50 mg于50 mL燒杯中，加入二氯甲烷5 mL、95%乙醇5 mL、吐溫80 0.2 mL，在50℃恒溫水浴鍋上充分振搖使其完全溶解;10 mg利奈唑胺置50 mL燒杯中，加緩沖液5 mL使溶解;將兩溶液混合后超聲3～5 min，再于40℃下減壓旋轉蒸發除去有機溶劑并形成均勻薄膜，加入40 mL 緩沖液，使膜溶解即得利奈唑胺脂質體[6-13]。

2.5 利奈唑胺脂質體制備處方工藝的單因素考察及結果[14]

在固定其他因素不變的前提下，分別對卵磷脂-膽固醇質量比、緩沖液pH、超聲時間、旋轉蒸發儀轉速四個關鍵制備條件進行單因素考察，選取包封率最大的因素作進一步優化，其結果顯示膽卵比（A）、緩沖液pH（B）、超聲時間（C）為對包封率影響較大因素，見圖3。

2.6 響應面法篩選最佳處方組成[15]

以單因素考察結果上下浮動設置三個梯度，通過Design Expert 8.0.6數據處理軟件設計出的17組實驗設計如表1所示，其中以利奈唑胺脂質體的包封率（Y）為響應值，其實驗結果如表1所示。

2.6.1 顯著性實驗結果? 根據2.6項中的實驗數據，得到了關于利奈唑胺脂質體包封率（Y）和3個試驗因素的回歸方程為：Y=78.79+3.72A+1.84B+0.75C+1.80AB-0.12AC+1.01BC-8.81A2-11.42B2-9.03C2。方程中各項系數的絕對值大小反映各因素對響應值的影響程度，各項系數的正負反映各因素的影響方向，在本回歸方程中，三個一次項系數值：A>B>C，故各因素的影響順序為膽卵比>緩沖液pH>超聲時間。

應用SPSS19.0軟件對因變量與自變量進行多重線性回歸分析，結果顯示模型的顯著水平P<0.0001，表明模型的顯著性高;其中失擬項>0.05，不顯著，說明模型與得到的實驗值的差異小;而且R2=0.9684，R2Adj=0.9942，兩者數值較為接近，說明本次實驗的真實值和預測值相差較小，故可以應用本方程優化利奈唑胺脂質體的處方組成。見表2。

2.6.2響應曲面分析結果? 在軟件中繪制相應的響應面和等高線圖，以此分析三個單因素兩兩之間的交互作用。兩個因素間相互作用程度的強弱皆可以通過響應面的形狀及等高線的特征來反映。

由圖4可知，等高線呈橢圓形，說明A、B兩因素交互作用明顯，響應曲面較為陡峭，跨度較大，說明利奈唑胺脂質體的包封率受這兩個因素交互作用的影響較大。等高線與膽固醇-卵磷脂質量比的軸線相交更為密集，表明膽固醇-卵磷脂質量比對利奈唑胺脂質體包封率的影響更大。

在圖5中，等高線圖為橢圓形，表明兩因素交互作用明顯，而且響應曲面比較陡峭，表明利奈唑胺脂質體包封率受這兩個因素交互作用的影響。等高線與膽固醇-卵磷脂質量比的軸線相交更密集，說明利奈唑胺脂質體的包封率受膽固醇-卵磷脂質量比的影響更大。

由圖6可知，等高線的圖形為橢圓形，說明被考察因素之間交互作用明顯，由于等高線與緩沖液pH的軸線相交更為密集，說明緩沖液pH對利奈唑胺脂質體包封率的影響較大。

最終系統給出最佳的處方組成為：膽固醇-卵磷脂質量比為1：2.45，其中膽固醇為50 mg，卵磷脂為122.5 mg，PBS緩沖液的pH值為6.65，超聲時間為3.2 min，旋轉蒸發儀轉速為50 r。

2.7 驗證試驗結果

以上述最佳處方組成及制備工藝制備三批平行樣本測定結果如表3所示，三批脂質體的平均包封率為78.19%，且RSD值小于2%，說明采用逆相蒸發法制備脂質體的可行度較高。

2.8 脂質體的形態觀察結果

為觀察載藥脂質體形貌，對載藥脂質體進行熒光染色（圖7），使用NBD-PE熒光染色劑染色后的利奈唑胺脂質體呈現出黃綠色，如圖8。在倒置熒光顯微鏡可以觀察到利奈唑胺脂質體的外觀為橢球形且較為圓整如封三圖8，平均粒徑范圍（610±26）nm，如圖9所示。

3 討論

3.1 脂質體作為藥物載體的缺點

脂質體膜為磷脂雙分子層結構，其膜具有流動性，造成被包封藥物易于泄露，導致脂質體載藥量下降，在混懸液pH值發生改變或溫度發生變化的特殊條件下，脂質體容易產生聚集、融合現象，由于脂質體的組成為磷脂類物質，易發生氧化，因此在實際生產制備脂質體的過程中應加入適量抗氧化劑，保證脂質體的穩定性。

3.2 膽固醇在脂質體制備過程中的應用

在制備脂質體的過程中，膽固醇作為構成脂質體膜的重要組成，對于膜的流動性起到重要的調節作用，因此加入膽固醇有利于提高脂質體膜的穩定性，降低藥物的泄露率。

3.3 Box-Behnken響應面分析法的優勢

Box-Behnken響應面分析法是較為科學的分析方法，其通過對實驗結果進行科學的數學建模并對實驗數據進行精確的統計分析，從而得出最佳方案，Box-Behnken 效應面法可連續對試驗各水平進行分析，在反映各因素不同程度對制備工藝影響的同時，還直觀體現了因素間的交互作用，相對均勻設計與正交設計試驗具有實驗精度高、預測性好的優勢。

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（收稿日期：2019-08-30）