苦參堿對TGF-β1誘導的人腹膜間皮細胞ETS2表達的影響

李福記 梁靖梅 段秀萍

[摘要] 目的 轉錄因子ETS2在器官纖維化的發(fā)生及進展中具有重要的作用，研究苦參堿對其在腹膜間皮細胞中表達的影響及其對腹膜纖維化防治的重要意義。 方法 將人腹膜間皮細胞按處理方法分為空白對照組、TGF-β1誘導組、TGF-β1+0.4 mg/mL苦參堿干預組、TGF-β1+0.8 mg/mL苦參堿干預組和TGF-β1+1.2 mg/mL苦參堿干預組，TGF-β1刺激人腹膜間皮細胞并分別予不同濃度的苦參堿干預處理，相對實時熒光定量PCR檢測α-SMA和E-cadherin的mRNA表達水平，然后用mRNA-seq分析ETS2的mRNA表達水平，相對實時熒光定量PCR和免疫蛋白印跡驗證ETS2的mRNA和蛋白的表達水平。 結果 TGF-β1刺激能上調人腹膜間皮細胞ETS2的mRNA和蛋白的表達水平，上調α-SMA的mRNA表達水平，下調E-cadherin的mRNA表達水平;苦參堿能下調TGF-β1刺激后的ETS2基因mRNA和蛋白的表達水平，下調TGF-β1刺激后α-SMA的mRNA表達水平和上調TGF-β1刺激后的E-cadherin的mRNA表達水平。 結論 苦參堿通過抑制轉錄因子ETS2的表達阻止人腹膜間皮細胞間充質轉化。

[關鍵詞] 苦參堿;ETS2基因;人腹膜間皮細胞;間充質轉化

[Abstract] Objective The transcription factor ETS2 plays an important role in the occurrence and progress of organ fibrosis. It is important to study the effect of Matrine on its expression in peritoneal mesothelial cells and its prevention and treatment of peritoneal fibrosis. Methods HPMC were divided into blank control group， TGF-β1-induced group， TGF-β1+0.4 mg/mL matrine intervention group， TGF-β1+0.8 mg/mL matrine intervention group and TGF-β1+1.2 mg/mL matrine intervention group， according to different processing methods. TGF-β1 was applied to stimulate HPMC and treated with matrine intervention of different concentrations. The mRNA expression levels of α-SMA and E-cadherin were detected by relative real-time fluorescent quantitative PCR， then the mRNA expression levels of ETS2 were analyzed by mRNA-seq， and the mRNA and protein expression levels of ETS2 were verified by relative real-time fluorescent quantitative PCR and immunoprotein printing. Results TGF-β1 stimulation can up regulate the expression level of ETS2 mRNA and protein， up regulate the expression level of α-SMA， down regulate the expression level of E-cadherin mRNA. Matrine can down regulate the expression level of ETS2 gene mRNA and protein after TGF-β1 stimulation， down regulate the expression level of α-SMA after TGF-β1 stimulation and up regulate the expression level of E-cadherin after TGF-β1 stimulation. Conclusion Matrine can prevent mesenchymal transformation of HPMC by inhibiting the expression of transcription factor ETS2.

[Key words] Matrine; ETS2 gene; Human peritoneal mesothelial cells; Mesenchymal transformation

人腹膜間皮細胞在終末期腎病（End-stage renal disease，ESRD）患者腹膜透析中具有重要的生物學功能，長期腹膜透析過程中腹膜間皮細胞不斷受物理和炎癥等刺激會發(fā)生間充質轉化，最終發(fā)展為腹膜纖維化。由此可見，腹膜間皮細胞間充質轉化是腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展的早期重要過程[1]。腹膜透析是ESRD患者重要替代療法之一[2，3]，而腹膜纖維化的發(fā)生會導致超濾量下降，患者無法再進行腹膜透析。因此，研究腹膜間皮細胞間充質轉化的分子機制并探索抑制其轉分化的相關藥物，對防治腹膜纖維化具有重要意義。

轉化因子ETS2具有E26轉換特異性序列，它能與位于靶基因啟動子區(qū)域的特異性核心GGAA/T序列相互作用，并調控該區(qū)域許多基因的轉錄[4，5]。研究證實ETS2參與多種細胞功能，包括凋亡、增殖、轉化、遷移和血管生成[6，7]。此外，還有許多研究報道了ETS2通過調節(jié)基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）和ECM蛋白的表達參與細胞外基質重構及影響腫瘤的發(fā)生、創(chuàng)傷的修復和心血管疾病的發(fā)生[8-10]。近年來，研究表明ETS2也參與了肺和腎臟等器官纖維化的發(fā)生與發(fā)展[11，12]。本研究ETS2在TGF-β1誘導的人腹膜間皮細胞間充質轉化中的作用分子機制及苦參堿對其表達的影響，為尋求有效抑制腹膜間皮細胞間充質轉化的新方法提供科學依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人腹膜間皮細胞系（HPMC）購買于廣州吉賽科技有限公司，苦參堿購于北京博奧拓達科技有限公司（CAS NO：16837-52-8），ETS2、α-SMA和E-cadherin單克隆抗體購于CST公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組? 將人腹膜間皮細胞按照不同處理方法分為空白對照組（完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）、TGF-β1誘導組（給予5 ng/mL TGF-β1刺激48 h）、TGF-β1+0.4 mg/mL苦參堿干預組（給予5 ng/mL TGF-β1+0.4 mg/mL苦參堿處理48 h）、TGF-β1+0.8 mg/mL苦參堿干預組（給予5 ng/mL TGF-β1+0.8 mg/mL苦參堿處理48 h）和TGF-β1+1.2 mg/mL苦參堿干預組（給予5 ng/mL TGF-β1+1.2 mg/mL苦參堿處理48 h）。

1.2.2 人腹膜間皮細胞培養(yǎng)及藥物干預? 復蘇細胞并傳代培養(yǎng)，待細胞長至80%融合時胰酶消化，接種于6孔板中培養(yǎng)，待細胞長至70%～80%時進行干預實驗。誘導人腹膜間皮細胞EMT的TGF-β1濃度為5 ng/mL，苦參堿干預處理的濃度分別為0.4 mg/mL、0.8 mg/mL和1.2 mg/mL。

1.2.3 相對實時熒光定量PCR（RT-PCR）和免疫蛋白印跡? RT-PCR：細胞干預處理48 h后收集細胞，根據(jù)天根RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，紫外分光光度計測量RNA濃度與純度，瓊脂糖凝膠電泳驗證完整性后，根據(jù)Takara逆轉錄試劑盒說明書合成單鏈cDNA，以cDNA為模板在ABI 7500實時熒光定量PCR儀上擴增目的片段。擴增引物在Pubmed數(shù)據(jù)庫中在線設計，送上海生物工程股份有限公司進行合成（序列見表1）。免疫蛋白印跡：收集細胞提取總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉PVDF膜，抗原封閉1 h后，4℃孵育一抗過夜，二抗孵育1 h，全能型凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.2.4 mRNA-seq分析? 樣品提取總RNA后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer，使其片斷成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers）合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二鏈，經過Quick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫經末端修復、加堿基A，加測序接頭，再經瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進行PCR擴增，從而完成整個文庫制備工作，構建好的文庫用Illumina HiSeq 2000進行測序。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義;柱狀圖采用GraphPad Prism 5.0進行繪制。

2 結果

2.1 苦參堿對人腹膜間皮細胞E-cadherin和α-SMA的mRNA表達水平的影響

5 ng/mL TGF-β1誘導人腹膜間皮細胞間充質轉化，同時予0.4 mg/mL、0.8 mg/mL和1.2 mg/mL濃度苦參堿干預處理48 h后，實時熒光定量PCR檢測E-cadherin和α-SMA的mRNA表達水平。結果顯示，5 ng/mL TGF-β1誘導人腹膜間皮細胞48 h后發(fā)現(xiàn)E-cadherin的mRNA表達下調，而α-SMA的mRNA表達上調;低、中和高濃度苦參堿干預處理后發(fā)現(xiàn)E-cadherin的mRNA表達上調，而α-SMA的mRNA表達下調。見表2。

2.2 mRNA-seq分析ETS2的mRNA表達水平

實驗分為空白對照組、TGF-β1誘導組和0.8 mg/mL苦參堿干預組處理細胞48 h后提取總RNA送公司進行mRNA-seq結果顯示TGF-β1誘導能顯著上調ETS2，而苦參堿干預后能顯著下調ETS2的mRNA表達水平。見表3。

2.3 RT-PCR和免疫蛋白印跡分別驗證ETS2的mRNA和蛋白的表達水平

5 ng/mL TGF-β1誘導人腹膜間皮細胞間充質轉化，同時予0.8 mg/mL苦參堿干預48 h后發(fā)現(xiàn)ETS2的mRNA和蛋白表達水平顯著上調，同時給予0.8 mg/mL苦參堿干預處理能顯著下調其mRNA和蛋白表達水平。見圖1、表4。

3 討論

腹膜間皮細胞間充質轉化在腹膜纖維化的發(fā)生與發(fā)展中起著關鍵的作用，研究其分子機制并探索有效抑制其間充質轉化的藥物具有重要意義。研究表明，TGF-β1能誘導小鼠腹膜間皮細胞間充質轉化[13]，是導致腹膜纖維化的主要因子之一[14]。本研究通過TGF-β1誘導人腹膜間皮細胞間充質轉化，研究結果顯示TGF-β1能下調人腹膜間皮細胞E-cadherin的表達水平和上調人腹膜間皮細胞α-SMA的表達水平。另外，還發(fā)現(xiàn)了苦參堿能通過上調E-cadherin的表達水平和下調α-SMA的表達水平對TGF-β1誘導的人腹膜間皮細胞間充質轉化具有明顯抑制作用。

研究表明，TGF-β1刺激人腹膜間皮細胞后會激活Smad依賴和非依賴信號通路，其中Smad依賴信號通路主要通過磷酸化其關鍵因子Smad2和Smad3，再與Smad4形成異二聚體，然后進入細胞核調控相關靶基因的轉錄;而Smad非依賴信號通路主要是TGF-β1與其受體結合后通過激活ERK1/2、JNK和PI3K/Akt等信號通路繼而調控腹膜間皮細胞間充質轉化的相關基因表達[14]。ETS2作為ERK1/2信號通路的下游因子，在腎和肺等器官中的致纖維化作用已有研究報道[11，12]，Yao F等[12]研究認為TGF-β1與其受體結合后會使ERK1/2磷酸化，磷酸化后的ERK1/2再作用于轉錄因子ETS2，進而調控相關基因的表達使腎小管上皮細胞間充質轉化。然而，目前ETS2在腹膜間皮細胞間充質轉化及腹膜纖維化中的作用并未見相關研究報道，本研究結果顯示TGF-β1能通過下調E-cadherin的表達水平和上調α-SMA的表達水平，誘導人腹膜間皮細胞間充質轉化，并通過mRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)TGF-β1刺激人腹膜間皮細胞間充質轉化后，ETS2的表達顯著上調，提示ETS2在腹膜間皮細胞間充質轉化中也起著重要作用;研究結果還顯示了苦參堿能有效抑制TGF-β1誘導后ETS2的異常高表達。這些研究結果提示，苦參堿可能是通過抑制轉錄因子ETS2的表達來調控腹膜間皮細胞間充質轉化相關基因的表達，進而阻止腹膜纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

苦參堿是一種具有解熱鎮(zhèn)痛、抑菌、抗病毒、調節(jié)免疫、強心、降壓、提高機體免疫力等功效的生物堿。研究表明，其在肝、肺和心臟等器官纖維化中具有抗纖維化的作用[15-17]。本研究結果提示苦參堿在抑制腹膜間皮細胞間充質轉化和抗腹膜纖維化中也具有重要作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1能誘導人腹膜間皮細胞間充質轉化。同時發(fā)現(xiàn)苦參堿能通過上調E-cadherin的表達和下調α-SMA和ETS2的表達抑制TGF-β1誘導的人腹膜間皮細胞間充質轉化，提示苦參堿可能抑制轉錄因子ETS2基因的表達來阻止人腹膜間皮細胞間充質轉化的發(fā)生，最終防止腹膜纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

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（收稿日期：2019-11-27）