響應面法優化水溶性虎奶菇多糖提取工藝及其對胃癌細胞的抑制作用

徐軍軍,李治堃,黃飛龍,王夢楠,陳星光,席慧婷,鄧丹雯,黃贛輝,*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學瑪麗女王學院,江西南昌 3300473.江西輝瑞制藥有限公司,江西南昌 330100)

虎奶菇,是一種子實體和菌核均可食用的珍稀食用兼要用真菌[1],主要分布在我國云南省、印度、印度尼西亞及馬來西亞等國,含有豐富的蛋白質、多糖等活性成分[2-3],其生物活性值得廣泛關注。

近年來天然提取物的抑癌研究備受中外學者青睞,從天然產物中探索出安全有效的抗腫瘤成分成為研究熱點。研究表明,海帶[4]、魚腥草[5]、烏頭[6]、紅花[7]中的提取的多糖均具有一定的抑癌效果。菇類菌核多糖也具有多種生物活性,霍宗慶[8]等從白玉菇中提取多糖,并利用單因素和響應面法優化其提取工藝,最優參數為提取溫度80 ℃、提取時間4.2 h、料液比1∶35,在此條件下提取白玉菇多糖的得率為6.41%。賈毓寧等[9]對猴頭菇多糖提取條件進行優化,并發現其多糖具有良好的抗氧化性。Mei Zhan等[10]將虎奶菇菌核中6種非水溶性虎奶菇菌核多糖硫酸化之后得到S-TM8,具有明顯的抗病毒效果。陶永真等[11]從虎奶菇菌核中提取出一種水溶性葡聚糖,并制備其硫酸酯衍生物,證實該衍生物具有體內抗肉瘤S-180活性及體外抗肝癌HepG2活性。目前,國內外對虎奶菇的報道主要集中在栽培及品種改良等方面,其水溶性菌核多糖的提取工藝優化很少有過報道。

本研究利用水提、醇沉法提取水溶性虎奶菇菌核多糖,經Sevage除蛋白、透析、冷凍干燥獲得精多糖,并利用單因素和響應面優化其提取條件;以胃癌細胞SGC-7901為研究對象考察該多糖體外抗胃癌活性,通過WST-1細胞增殖檢測試劑盒以及流式細胞術研究不同濃度的該多糖溶液對胃癌細胞增殖率和早期凋亡的影響,為后續探究虎奶菇抗胃癌活性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

虎奶菇菌核 江西省撫州市臨川金山食用菌專業合作社提供,用PBS溶解,配制儲存液濃度為1.25 mg/mL;葡萄糖系列標準品 中國科學計量所;RPMI-1640細胞培養基、青鏈霉素、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA消化液 北京索萊寶科技有限公司;WST-1和Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司;無水乙醇、硫酸 上海振興化工一廠;苯酚 北京索萊寶科技有限公司;人胃癌細胞株SGC-7901 武漢普諾賽生命科技有限公司提供,培養傳代于含10%胎牛血清、1%的雙抗(青霉素+鏈霉素)RPMI-1640 培養基中,置于 5% CO2、37 ℃ 恒溫培養箱,選取對數生長期的細胞進行實驗。

高效液相色譜儀 Waters公司;722N型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;FACS Calibur TM流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司;Varioskan Flash多功能酶標儀 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的提取工藝 虎奶菇破碎至直徑為2 cm左右的顆粒,烘干過40目篩,于95%的乙醇溶液中浸泡12 h,除去虎奶菇菌核中的脂溶性雜質。稱取一定質量的虎奶菇粉末,按照一定的料液比與蒸餾水混合,90 ℃水浴中提取一定時間。收集合并濾液,用旋蒸儀在60 ℃進行濃縮,至原體積的十分之一時,以體積比(溶液∶95%乙醇溶液)=16∶3的比例沉淀多糖,4800 r/min離心15 min,得到粗多糖。

取適量粗多糖溶液用Sevage法進行脫蛋白,4800 r/min離心15 min,重復上述操作一次,上清液分別在自來水中透析2 d,蒸餾水中透析1 d。濃縮透析液,冷凍干燥即得到虎奶菇純化多糖。

1.2.2 單因素實驗 分別研究料液比、提取時間、提取溫度對虎奶菇菌核多糖得率的影響。主要包括以下步驟,稱取同一批次的虎奶菇20 g,分別設置不同的料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)在90 ℃水浴條件下提取2.5 h;料液比為1∶25 g/mL,在90 ℃水浴條件下提取不同時間(1、2、3、4、5 h);料液比為1∶25 g/mL在不同提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)條件下提取4 h,按1.2.1提取工藝進行操作,測定各組菌核粉末多糖得率。

1.2.3 響應面試驗 根據單因素實驗結果,選擇料液比(A)、提取溫度(B)、提取溫度(C)作為自變量,以虎奶菇菌核多糖得率(Y)作為響應值,采用Box-Benhnken的中心組合實驗設計響應曲面法對水溶性虎奶菇菌核多糖提取條件進行優化分析。

表1 響應曲面因素水平編碼表Table 1 Factors and levels coding of response surface

1.2.4 虎奶菇純化多糖得率的測定

1.2.4.1 葡萄糖標準曲線的繪制 采用苯酚-硫酸法[12-13]。準確稱取100 mg葡萄糖標準品，用去離子水溶解，定容到100 mL，制備成1 mg/mL的標準葡萄糖溶液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標準葡萄糖溶液，用去離子水定容到10.0 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，5 mL濃硫酸，振搖，靜置30 min在490 nm處測定各溶液的吸光度。以葡萄糖標準溶液濃度為橫軸，吸光度為縱軸繪制標準曲線。得葡萄糖標準曲線為y=8.7146x+0.0143(R2=0.999)，其中x為多糖濃度(以葡萄糖計；mg/mL)，y為所多糖的吸光度。

1.2.4.2 虎奶菇純化多糖的測定 稱1.0 g純化多糖溶于100 mL去離子水配制成多糖待測液，取0.5 mL多糖待測液，用去離子水定容至10 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，5 mL濃硫酸，振搖，靜置30 min在490 nm處測定其吸光度，并根據葡萄糖標準曲線計算待測液的純化多糖的濃度。

1.2.4.3 虎奶菇純化多糖得率的計算 根據公式計算虎奶菇純化多糖的得算公式如下：

式(1)

1.2.5 細胞增殖實驗 取對數生長期人胃癌細胞株SGC-7901細胞接種到96孔板中,每孔加入100 μL(約6×103個細胞)的 RPMI-1640細胞培養基(含10%胎牛血清、1% 的雙抗)。待細胞貼壁后,棄掉原培養基,實驗組中加入用RPMI-1640 細胞培養基稀釋虎奶菇菌核儲備液而成的不同濃度虎奶菇菌核多糖溶液(終濃度分別為3.0、7.5、15、30、60、125、250、500 μg/mL),陰性對照組中加入等體積的PBS作為空白對照,每組設定6個復孔,置于恒溫培養箱中孵育24 h。然后向每孔加入10 μL WST-1溶液,繼續在恒溫箱中孵育1.5 h,孵育結束后將96孔板置于搖床上搖動1 min以充分混合待檢體系,用酶標儀于450 nm處測量吸光(OD)值[15]。按式(2)計算虎奶菇菌核多糖對胃癌細胞SGC-7901的增殖率(θ):

式(2)

式中:OD1和OD2分別為陰性對照組和試驗組的吸光值。

1.2.6 細胞凋亡影響試驗-Annexin V-FITC/PI雙熒光染色法 取對數生長期人胃癌細胞株SGC-7901細胞接種到6孔板中,每孔加入1 mL(約6×105個細胞)的RPMI-1640完全培養基,過夜,待細胞貼壁后,棄掉原培養基,加入含有不同質量濃度樣品的RPMI-1640完全培養基1 mL(分別為0、20、50和100 μg/mL),等體積的PBS作為陰性對照組,恒溫培養箱中培養24 h。到達孵育時間后用預冷PBS洗滌細胞2～3遍,每孔加入200 μL不含EDTA的胰蛋白酶消化液消化細胞,2 min后加入1 mL完全培養基終止消化,然后將細胞輕柔的吹打下來,混勻后轉移至離心管內,1500 r/min離心5 min,棄去上清液,加1 mL PBS重懸細胞,1000 r/min離心5 min除去殘留培養基,棄上清液后加入500 μL的結合液重懸細胞,加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide,混勻,室溫下避光反應15 min,在1 h內進行流式細胞儀檢測[14]。

1.3 數據處理

根據Design-Expert 8.0.6軟件,設計響應面實驗方案,實驗數據采用軟件SPSS 19.0進行方差分析并用OriginPro 8.0進行作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對多糖得率的影響 如圖1所示,料液比在1∶10～1∶25范圍內,水溶性虎奶菇菌核多糖得率隨料液比的增加而增大,料液比為1∶25時多糖得率達到2.15%,當料液比增加到1∶30時,得率沒有明顯的增加,這是因為當料液比過高,溶出性雜質會增加,抑制多糖溶解,考慮到經濟性原則[13],因此選擇最佳料液比為1∶25。

圖1 料液比對多糖得率的影響Fig.1 Effect of ratio of material to liquid on yield of polysaccharide

2.1.2 提取時間對多糖得率的影響 如圖2所示,隨著提取時間的增加多糖得率逐漸增加,當提取時間達到4 h時得率達到2.49%。繼續增加提取時間,多糖得率呈下降趨勢,這可能是因為提取時間過長會導致其他可溶性雜質溶出,導致溶液黏度增加,抑制多糖溶解[15-16],因此確定最佳提取時間為4 h。

圖2 提取時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on yield of polysaccharide

2.1.3 提取時間對多糖得率的影響 如圖3所示,在提取溫度在60～90 ℃時,多糖得率隨提取溫度的升高明顯增加,在90 ℃使得到最大值,當繼續增加提取溫度得率下降,這可能是因為高溫提取條件使虎奶菇菌核多糖的結構遭到破壞,導致多糖溶出受阻[16],因此選擇90 ℃為最佳提取溫。

圖3 提取溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of polysaccharide

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 響應面模型建立及顯著性檢驗 響應面的實驗方案及結果見表2,方差分析見表3。采用軟件Design-Expert 8.0.6進行多元回歸擬合,得到多糖得率(Y)對各項因素的二次多項回歸方程為:Y=-19.98+0.43A+2.22B+0.24C-0.024AB+1.15×10-3AC-5.25×10-3BC-8.04×10-3A2-0.136 B2-1.335×10-3C2。由表3可知,模型F值為2634.73,P<0.0001,說明模型具有顯著性;失擬項F為3.75,P>0.05,說明失擬項差異不顯著,試驗無失擬因素存在,相關系數R2=0.9993,表明該模型具有極顯著的統計學意義,誤差較小,擬合度好,適用于虎奶菇菌核多糖提取工藝的優化。其中,料液比、提取時間、提取溫度及其之間的交互作用對虎奶菇菌核多糖的提取均具有顯著影響。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

表2 響應面實驗方案及結果Table 2 Response surface experimental scheme and results

2.2.2 響應面分析 圖4顯示了各因素及其交互作用對水溶性虎奶菇菌核多糖得率的影響,曲面圖反映多糖得率的大小。由圖可知,兩個因素的等高線均呈橢圓形,說明兩個因素之間的交互作用顯著。圖4(a)表明當時間在3.50～4.50 h之間,液料比在24～30 mL/g之間時,多糖得率最大;圖4(b)表明當溫度在90～100 ℃之間,液料比在26～28 mL/g時,多糖得率最大;由圖4(c)得當溫度在90～100 ℃樣品之間,時間在3.5～4.5 h時,多糖得率達到最大。

圖4 兩因素交互作用對多糖得率的影響響應面Fig.4 Response surface and contour map of the interaction on the extraction rate of polysaccharides

根據響應面優化結果,得到最佳提取工藝預測值:液料比為28.52 mL/g,時間為3.77 h,溫度為98.07 ℃時,多糖得率達到2.62%±0.3%。根據實際操作性將最佳工藝更正為以液料比28.0 mL/g,時間3.5 h,溫度98 ℃對多糖得率的最佳工藝進行驗證,試驗重復三次取平均值,得到多糖得率為2.59%±0.5%,與預測值接近,說明本模型預測多糖得率可靠,具有可行性。

2.3 體外抗SGC-7901胃癌細胞活性

2.3.1 虎奶菇菌核多糖對胃癌細胞增殖率的影響 圖5顯示了胃癌細胞SGC-7901的增殖率隨培養基中多糖濃度的變化趨勢,當多糖濃度小于30 μg/mL時,多糖對細胞增殖沒有抑制作用。相反,多糖作為碳源,促進了細胞的增殖。當多糖濃度達到15 μg/mL,細胞增殖開始受到抑制,當濃度達到60 μg/mL及以上時,細胞增殖率與多糖濃度呈顯著負相關,虎奶菇菌核多糖濃度為500 mg/mL時對胃癌細胞SGC-7901的抑制率達到了30.3%,說明水溶性虎奶菇菌核多糖對胃癌細胞SGC-7901的增殖具有一定的抑制作用。

圖5 藥物濃度對于細胞增殖率的影響Fig.5 Effect of drug concentration on cell proliferation注:*表示與空白對照具有顯著性差異(P<0.05)。

2.3.2 水溶性虎奶菇菌核多糖對胃癌細胞早期凋亡的影響 將胃癌細胞SGC-7901分別在多糖濃度為0、20、50和100 μg/mL的培養液中培養24 h,Annexin V-FITC/PI雙熒光染色處理后,流式細胞儀檢測結果如圖6所示,圖中的每個點代表一個特定染色狀態的細胞,其中右上象限的點表示Annexin+/PI+的壞死或晚期凋亡細胞,右下象限的點表示Annexin+/PI-的早期凋亡細胞。胃癌細胞SGC-7901經不同濃度多糖作用24 h后,總細胞數中處于早期凋亡的細胞比例隨著培養液中多糖濃度的增加逐漸升高。這說明水溶性虎奶菇菌核精多糖具有促進胃癌細胞SGC-7901早期凋亡的作用,且其功效隨濃度的升高而增大。

圖6 不同濃度下Annexin V-FITC和PI染色后流式細胞儀檢測細胞早期凋亡效果圖Fig.6 Flow cytometry after Annexin V-FITC and PI staining at different concentrations to detect early apoptosis effect注:a～d圖對應的多糖濃度為分別為0,20,50,100 μg/mL。

3 結論與討論

本研究通過單因素和響應面實驗優化提取未經純化的水溶性虎奶菇菌核多糖,確定最佳工藝條件:料液比1∶28 g/mL,提取時間為3.5 h,提取溫度為98 ℃,在此條件下虎奶菇菌核多糖的得率為2.59%±0.5%。細胞實驗表明,水溶性虎奶菇菌核多糖的濃度對SGC-7901細胞增殖具有抑制效果,并且隨著多糖濃度的增加,抑制效果越明顯。當多糖濃度為500 mg/mL時,對胃癌細胞的抑制率達到30.3%。

研究表明,白藜蘆醇、藤黃酸等通過誘導Bax、抑制BcL-2的基因表達實現細胞凋亡,從而達到抗癌效果[17-18];香菇多糖也是通過增強促凋亡因子Bax的表達、抑制抗凋亡因子BcL-2的表達來誘導腫瘤細胞凋亡,從而抑制胃癌細胞BGC-823的增殖[19-20]。水溶性虎奶菇菌核多糖誘導細胞凋亡的機理是否也遵循這一機理,尚需進一步研究證實。