黃花倒水蓮不同極性部位抗氧化和降血糖活性研究

姚志仁,李 豫,朱開梅,唐 輝,顧生玖,*

(1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,廣西桂林 541100;2.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所,廣西桂林 541100)

黃花倒水蓮(PolygalafallaxHemsl.)為遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志屬灌木或小喬木,又名假黃花遠(yuǎn)志、黃花參、倒吊黃、吊吊黃、念健、一身保暖、鴨仔兜等,其生長(zhǎng)于山谷林下水旁蔭濕處,主要分布于江西,福建、湖南、廣西和云南等地區(qū)[1]。黃花倒水蓮根入藥,性平,味甘、微苦有補(bǔ)氣血、利水滲濕、補(bǔ)脾補(bǔ)肝、活血調(diào)經(jīng)的功效,一般用于治療病后體虛、腰膝酸痛、跌打損傷、急慢性肝炎及抗衰老等[2]。其是壯族、瑤族、苗族等少數(shù)名族的常用藥[3],同時(shí)黃花倒水蓮也作為少數(shù)民族藥食兩用藥材[4]。近年來黃花倒水蓮的藥用價(jià)值被逐漸重視。

糖尿病是嚴(yán)重影響人體健康的疾病。糖尿病的發(fā)生與氧化有密切關(guān)系[5-6],抗氧化劑可減少自由基的產(chǎn)生或直接淬滅體內(nèi)產(chǎn)生的自由基,并增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力,是預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥的有效手段[7],淀粉中的葡萄糖以α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵的形式連接。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的參與是人體對(duì)食物中淀粉的消化吸收所必須的過程。唾液、腸道內(nèi)淀粉酶的活性可以通過α-淀粉酶抑制劑來抑制,從而阻礙食物中淀粉的消化吸收,來起到降血糖的作用[8]。目前常用的抗氧化劑及α-葡萄糖苷酶抑制劑多為西藥,存在較多毒副作用,也不能有效地控制并發(fā)癥,植物天然產(chǎn)物降糖作用具有多途徑、多靶點(diǎn)、多向性的藥理特點(diǎn),不僅可降低血糖,還具有抗氧化及降血脂作用[9-11]。α-葡萄糖苷酶抑制劑一般具有單糖或者寡糖結(jié)構(gòu),可有效地抑制糖水解酶的活性,起到有效控制糖尿病患者餐后血糖水平作用[12]。除此之外,α-葡萄糖苷酶抑制劑還具有抗癌、抗艾滋病病毒、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[13]。本文采用不同極性的溶劑對(duì)黃花倒水蓮乙醇提取物進(jìn)行萃取,并測(cè)定其各部位多酚,黃酮含量。同時(shí)對(duì)各部位進(jìn)行了抗氧化以及抑制α-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定,為進(jìn)一步研究和開發(fā)利用該植物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃花倒水蓮藥材 中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所提供,由中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所唐輝研究員鑒定為遠(yuǎn)志科植物黃花倒水蓮(PolygalafallaxHemsl)的干燥根莖;ABTS試劑盒 碧云天生物技術(shù)公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 梯希愛(上海)有限公司;抗壞血酸(VC) 天津福晨化工試劑公司;α-葡萄糖苷酶(5×106U/mL)、4-硝基苯-α-D-葡萄糖苷(pNPG) Sigma公司;阿卡波糖 百靈威科技有限公司;福林一酚(Folin-Ciocalteu)試劑 生工生物工程股份有限公司;沒食子酸 成都市科龍化工試劑廠;槲皮素 天津一方科技有限公司;所有分離用有機(jī)溶劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HC-350型四兩裝高速中藥粉碎機(jī) 武義海納電器有限公司;LQ-C30002型樂祺電子天平 上?，幮码娮涌萍加邢薰?ReadMax 1900型全波長(zhǎng)Epoch酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技有限公司;N-1210BV-W型EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃花倒水蓮提取物及萃取物制備 取自然風(fēng)干的黃花倒水蓮干燥品,粉碎,過40目篩,稱取粗粉800 g按料液比1∶10加入95%乙醇,室溫浸泡一周,抽濾并收集濾液,60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得黃花倒水蓮乙醇提取物,按照同樣方法提取三次。

采用有機(jī)溶劑萃取法[14-15]對(duì)黃花倒水蓮乙醇提取物進(jìn)行純化,稱取適量乙醇提取物用純凈水稀釋,采用等體積石油醚反復(fù)萃取樣品至石油醚層無色,采用同樣方法分別用乙酸乙酯、正丁醇、氯仿為萃取劑進(jìn)行萃取,得各部位萃取物以及萃取完剩下的水相部分。

1.2.2 黃花倒水蓮醇提物各萃取物中多酚含量的測(cè)定 參照國(guó)標(biāo)法GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》[16]中的多酚測(cè)定方法,配制一定濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)液,在760 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考文獻(xiàn)方法[17]并做修改稱取適量干燥沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品,純水稀釋,配制成0.02 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.25 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液參照國(guó)標(biāo)法,于760 nm處分別測(cè)定其吸光度。

1.2.2.2 多酚含量測(cè)定 按照國(guó)標(biāo)法配制[16]待測(cè)樣品溶液,于760 nm處測(cè)定其吸光度,以超純水代替待測(cè)樣品為空白對(duì)照。每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定三次。各待測(cè)樣品多酚含量表示為mg(沒食子酸當(dāng)量)/g(黃花倒水蓮各部位質(zhì)量)計(jì)算公式如下:

待測(cè)樣品中多酚含量 Z=cvk/m

式中:c為待測(cè)樣品稀釋后的多酚濃度(mg/mL)由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合得出;v為黃花倒水蓮各待測(cè)樣品提取液總體積(mL);k為待測(cè)樣品提取液稀釋倍數(shù);m為黃花倒水蓮各部位粉末重量(g)。

1.2.3 黃花倒水蓮醇提物各萃取物中黃酮含量的測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 參考文獻(xiàn)方法[18]并做修改稱取適量干燥槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品,純水稀釋,配制成0.125 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、2、4、6、8、10 mL于25 mL容量瓶中,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液0.7 mL,搖勻,溶液顏色無明顯變化,靜置5 min,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al(NO3)3溶液0.7 mL,再搖勻,顏色變淺,放置5 min后,加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的NaOH溶液,顏色變成紅色,再用60%乙醇定容至刻度線,搖勻,靜置15 min,測(cè)其在510 nm處吸光度值。

1.2.3.2 黃酮含量測(cè)定 按照文獻(xiàn)方法[19]配制待測(cè)樣品溶液,于510 nm處測(cè)定其吸光度,以超純水代替待測(cè)樣品為空白對(duì)照。每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定三次。各待測(cè)樣品黃酮含量表示為mg(槲皮素當(dāng)量)/g(黃花倒水蓮各部位質(zhì)量)計(jì)算公式如下:

待測(cè)樣品中黃酮含量Z=cvk/m

式中:c為待測(cè)樣品稀釋后的黃酮濃度(mg/mL)由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合得出;v為黃花倒水蓮各待測(cè)樣品提取液總體積(mL);k為待測(cè)樣品提取液稀釋倍數(shù);m為黃花倒水蓮各部位粉末重量(g)。

1.2.4 ABTS法測(cè)定各極性部位總抗氧能力

1.2.4.1 ABTS工作液的制備 按試劑盒說明取相同體積的ABTS溶液以及氧化劑溶液,室溫避光存放12～16h后,用80%乙醇稀釋至35～55倍。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 按ABTS試劑盒方法96孔板內(nèi)加入200 μL的ABTS工作液再加入10 μL(0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L)的Trolox溶液。輕輕混勻,室溫孵育2～6 min后于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.4.3 總抗氧能力測(cè)定 96孔板內(nèi)加入200 μL ABTS工作液,空白對(duì)照組加入10 μL PBS,樣品組加入10 μL不同濃度(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL)樣品。輕搖混勻。室溫孵育2～6 min,在405 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品總抗氧能力。

1.2.5 清除羥自由基活性測(cè)定 參考文獻(xiàn)方法[20-21],將黃花倒水蓮各部位分別稀釋為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL的溶液,相同濃度的VC溶液做對(duì)照。取1 mL樣品,分別加入1.8 mmol/L FeSO4溶液2 mL和1.8 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL,再加入0.03% H2O2溶液0.1 mL在37 ℃反應(yīng)30 min,8000 r/min離心10 min,510 nm測(cè)定吸光度。樣品對(duì)羥自由基的清除率按公式計(jì)算

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1:1.0 mL提取液+2.0 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸-乙醇+H2O2溶液;A2:1.0 mL提取液+2.0 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸-乙醇+蒸餾水A0:1.0 mL蒸餾水+2.0 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸-乙醇+H2O2溶液。

1.2.6 清除DPPH自由基活性測(cè)定 參考文獻(xiàn)方法[22-23]采用DPPH法。2 mL黃花倒水蓮提取物和萃取物乙醇溶液加入1 mL濃度為500 μmol/LDPPH-乙醇溶液?；旌暇鶆蚝笫覝乇芄夥磻?yīng)30 min,然后在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。陽性對(duì)照為VC,樣品對(duì)DPPH自由基的清除率按公式計(jì)算。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1:2.0 mL提取液+1.0 mL DPPH工作液;A2:2.0 mL提取液+1.0 mL無水乙醇;A0:2.0 mL純水+1.0 mL DPPH工作液。

1.2.7 不同溶劑黃花倒水蓮提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用 參考文獻(xiàn)方法[24-25]取10 μL不同濃度(0.25、0.5、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL)的黃花倒水蓮提取物加入96孔板內(nèi),再分別加入10 μL pH7.4磷酸緩沖鹽溶液,10 μL 0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液,充分混勻后放置37 ℃孵育15 min,再加入20 μL 3 mmol/L的PNPG溶液,再孵育10 min,加入150 μL 0.1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)。利用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定吸光度,分別設(shè)置空白組、對(duì)照組、樣品對(duì)照組。并計(jì)算其IC50大小。按照表1加樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn),同時(shí)以阿卡波糖為陽性對(duì)照。

表1 α-葡萄糖苷酶的抑制作用加樣表Table 1 Inhibitory sampling table of alpha-glucosidase

提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用按公式計(jì)算:

抑制率(%)=(1-(A1-A2)/A3)×100

式中:A1為樣品組吸光;A2為空白組吸光值;A3為對(duì)照組吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,進(jìn)行檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花倒水蓮乙醇提取物及各萃取物多酚的含量

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 經(jīng)線性擬合得回歸方程Y=19.04X+0.028,決定系數(shù)R2=0.9924,實(shí)驗(yàn)表明沒食子酸在0.01～0.05 mg/g濃度范圍內(nèi)沒食子酸濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(Y為吸光度,X為沒食子酸濃度)。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

2.1.2 黃花倒水蓮醇提物各萃取物多酚含量 黃花倒水蓮各部位多酚含量見表2。

表2 黃花倒水蓮醇提物各部位的多酚含量Table 2 Polyphenol content in different parts of alcohol extract of P. fallax.

實(shí)驗(yàn)測(cè)得乙酸乙酯部位多酚含量高達(dá)(483.9±0.8) mg/g,遠(yuǎn)高于其他部位多酚含量。黃花倒水蓮各萃取物中多酚含量依次為乙酸乙酯部位>氯仿部位>正丁醇部位>石油醚部位>水層部位。該結(jié)果表明黃花倒水蓮的多酚集中分布于乙酸乙酯部位,小極性的多酚所占比例較少。采用系統(tǒng)溶劑萃取法對(duì)黃花倒水蓮進(jìn)行分段萃取后可達(dá)到多酚的初步富集與分離的目的。

2.2 黃花倒水蓮乙醇提取物及各萃取物黃酮的含量

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 經(jīng)線性擬合得回歸方程Y=1.365X+0.001,決定系數(shù)R2=0.9931,實(shí)驗(yàn)表明槲皮素在0.00～0.05 mg/mL濃度范圍內(nèi)槲皮素濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(Y為吸光度,X為槲皮素濃度)。

圖2 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Quercetin standard curve

2.2.2 黃花倒水蓮各萃取物黃酮含量 黃花倒水蓮各萃取物黃酮含量測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 黃花倒水蓮各部位的黃酮含量Table 3 Flavone content in different parts of P.fallax.

實(shí)驗(yàn)測(cè)得石油醚部位黃酮含量高達(dá)(53.1±0.57) mg/g,遠(yuǎn)高于其他部位黃酮含量。黃花倒水蓮各萃取物中黃酮含量依次為石油醚部位>乙酸乙酯部位>氯仿部位>醇提總>正丁醇部位>水層部位。該結(jié)果表明黃花倒水蓮的黃酮集中分布于石油醚部位。且經(jīng)過初步分離后,石油醚部位黃酮含量遠(yuǎn)高于醇提物黃酮含量說明采用系統(tǒng)溶劑萃取法對(duì)黃花倒水蓮進(jìn)行分段萃取后可達(dá)到黃酮的初步富集與分離的目的。

2.3 ABTS法測(cè)定黃花倒水蓮各萃取部位總抗氧能力

采用總抗氧能力檢測(cè)試劑盒(ABTS法)對(duì)黃花倒水蓮各提取物進(jìn)行抗氧化活性檢測(cè),結(jié)果顯示各提取物均有一定的抗氧化活性。

2.3.1 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線 Trolox的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Trolox standard curve

2.3.2 各萃取物的總抗氧能力 如圖4所示黃花倒水蓮各極性部位均有一定的抗氧化能力,且在0～0.8 mg/mL濃度范圍內(nèi),各萃取層總抗氧能力隨著濃度的增長(zhǎng)而增長(zhǎng),總體呈現(xiàn)線性關(guān)系。且其抗氧化能力順序?yàn)橐宜嵋阴ゲ课?石油醚部位>氯仿部位>正丁醇部位>醇提部位>水相部位,乙酸乙酯部位總抗氧能力在0.8 mg/mL時(shí)高達(dá)(1.027±0.031) mmol·L-1,遠(yuǎn)高于同濃度下其他各部位。

圖4 黃花倒水蓮各部位總抗氧能力Fig.4 Total antioxidant capacity of various parts of P.fallax

2.4 對(duì)羥自由基的清除能力

黃花倒水蓮乙醇提取物及其各萃取物對(duì)羥自由基均表現(xiàn)出不同程度的清除作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)乙酸乙酯部位清除羥自由基的活性最強(qiáng),乙酸乙酯部位在濃度0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL對(duì)羥自由基的清除率分別為57.1%、64.2%、64.9%、79.0%、92.8%,乙酸乙酯部位各濃度對(duì)羥自由基的清除率均高于同濃度下其他各部位清除作用與陽性對(duì)照品VC相當(dāng),而0.8 mg/mL濃度下氯仿部位、正丁醇部位、石油醚部位、醇提部位、水相部位清除率分別為83.2%、72.6%、67.0%、61.2%、50.7%。黃花倒水蓮醇提物及其各萃取物對(duì)羥自由基清除率大小依次為:乙酸乙酯部位>氯仿部位>正丁醇部位>石油醚部位>醇提部位>水相部位。黃花倒水蓮具有抗氧化活性的成分主要集中在乙酸乙酯部位。

圖5 各萃取極分對(duì)羥自由基清除率Fig.5 Scavening rate of extraction fraction against ·OH

2.5 對(duì)DPPH自由基清除作用

黃花倒水蓮醇提物及其各提取部位清除DPPH自由基活性測(cè)定結(jié)果如圖6所示,黃花倒水蓮醇提物及其各提取部位對(duì)DPPH自由基顯示出不同程度的清除活性,隨著濃度升高,對(duì)DPPH自由基清除率呈現(xiàn)線性關(guān)系;乙酸乙酯部位在濃度0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基清除率分別為62.9%、69.1%、77.7%、87.6%、93.3%;而當(dāng)濃度為0.8 mg/mL時(shí),正丁醇部位、氯仿部位、石油醚部位、醇提部位、水相部位清除率分別為83.4%、79.3%、70.2%、68.8%、50.2%,乙酸乙酯部位各濃度對(duì)DPPH自由基清除率均遠(yuǎn)高于同濃度下其他部位。黃花倒水蓮各部位對(duì)DPPH自由基的清除率大小順序?yàn)橐宜嵋阴ゲ课?正丁醇部位>氯仿部位>石油醚部位>醇提物>水相部位。

圖6 各萃取極分對(duì)DPPH自由基清除率Fig.6 Scavenging rate of each extraction fraction against DPPH free radical

2.6 不同溶劑黃花倒水蓮萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

不同溶劑黃花倒水蓮萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制率(IC50)和不同溶劑萃取物的抑制作用結(jié)果見圖7。

圖7 不同萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制率Fig.7 Semi-inhibitory rate of different extracts on α-glucosidase

通過黃花倒水蓮不同濃度(0.25、0.5、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL)抑制率計(jì)算其IC50。各有效部位均對(duì)α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用,乙酸乙酯部位抑制效果最為明顯。黃花倒水蓮各部位對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果:乙酸乙酯部位>正丁醇部位>氯仿部位>醇提物>石油醚部位>水相部位。而乙酸乙酯部位IC50為(0.064±0.013) mg/mL,正丁醇部位為IC50為(0.559±0.012) mg/mL均要優(yōu)于陽性對(duì)照阿卡波糖IC50(0.867±0.032) mg/mL。說明黃花倒水蓮中發(fā)揮α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性成分主要溶解在乙酸乙酯部位。

3 結(jié)論

本研究表明黃花倒水蓮各極性部位均有一定的抗氧化活性,相同質(zhì)量濃度下乙酸乙酯部位抗氧化活性優(yōu)于其他部位。乙酸乙酯部位多酚含量最高(483.9±0.8) mg/g,而黃酮含量最多的為石油醚部位(53.1±0.57) mg/g,表明在黃花倒水蓮中總多酚有較好的抗氧化活性作用。通過實(shí)驗(yàn)證明其乙酸乙酯部位對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陽性對(duì)照阿卡波糖。阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制率(IC50)為(0.867±0.032) mg/mL,而乙酸乙酯部位對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制率(IC50)為(0.064±0.013) mg/mL。綜上證明乙酸乙酯部位為黃花倒水蓮抗氧化降血糖最有效部位。通過本實(shí)驗(yàn)可以初步確定該活性部位中主要活性物質(zhì)為多酚類化合物,其最優(yōu)的單一活性成分還需做進(jìn)一步研究。