土豆中酪氨酸酶的提取及植物精油對其激活作用與動力學研究

陳懷慶,廖興宏,趙 慧,楊俊棋,王文君,張 巖

(遵義醫科大學珠海校區生物工程系,廣東珠海 519041)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)普遍存在于生物體中,是多功能含銅氧化酶[1],可以作為酪氨酸羥化酶、多巴氧化酶,是產生黑色素的決定性酶[2],也是引起蔬果褐變的關鍵酶[3]。其廣泛存在于動植物體內,其中土豆、蘑菇中含量尤為豐富[4],研究表明從土豆中提取酪氨酸酶,并用分光光度法測定其活性一直是簡便、可行的方式[5-6]。

研究發現上調酪氨酸酶活性可以增加黑色素生成,是目前篩選白癜風治療藥物一種方法。從天然植物中尋找酪氨酸酶激活劑是目前研究的熱點[7-9]。植物精油是植物體內的次生代謝產物,主要由小分子化合物組成,氣味芳香易揮發。研究發現含有精油的天然藥物配方對白癜風模型的動物具有治療效果[10-11]。因此,植物精油在激活酪氨酸酶,治療白癜風等疾病方面具有應用前景和開發潛力。但目前關于植物精油對酪氨酸酶研究多側重在抑制作用[12-13],涉及精油類型較多如花香類、香草類、柑橘類、辛香類和土香類[14-15],多用于美白護膚。而植物精油對酪氨酸酶的激活作用的研究較少,只有佛手柑類精油[16]、茶油[17]等簡單幾種。而關于百里香、茶樹、依蘭精油在抑菌和祛痘方面研究較多[18-19]，對酪氨酸酶活性的研究未見報道。

目前針對植物精油對酪氨酸酶的激活作用研究較為缺乏的現狀。本課題將研究植物精油對酪氨酸酶的活性影響,尋找天然酪氨酸酶激活劑,為白癜風的治療奠定基礎。研究內容主要有:優化土豆中酪氨酸酶提取工藝與反應條件;采用多巴速率氧化法評價植物精油對酪氨酸酶的活性影響;通過酶動力學實驗研究植物精油的激活機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮土豆 貴州省甕安縣;L-多巴 上海麥克林生化有限責任公司;補骨脂素 陜西飛宇生物技術有限公司;橘子、尤加利、杜松、冬青、桂皮、羅勒、薄荷、歐白芷、茶樹、百里香、桂花、百合、綠化白千層、依蘭、佛手柑植物精油 卡根生物科技有限公司;氫氧化鈉 天津市大茂化學試劑廠;磷酸氫二鉀 汕頭市光華化學試劑有限公司;磷酸二氫鉀 天津市大茂化學試劑廠;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide DMSO) 天津市大茂化學試劑廠;其余試劑 均為分析純。

UV6200紫外分光光度計 日本島津公司;JP-1500B粉碎機 永康市久品工貿有限公司;Centrifuge 5424R高速冷凍離心機 德國艾本德公司;KQ-300DE超聲儀 昆明市超聲儀器有限公司;DLSB-10L/20旋轉蒸發器 鞏義市予華儀器有限責任公司;SHHW21.600AⅡ三用電熱恒溫水箱水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 土豆中酪氨酸粗酶的提取條件的確定 取新鮮土豆去皮切成1 cm×1 cm×1 cm塊狀,放置于封口袋中,-20 ℃冷凍,備用[20]。取冷凍土豆10 g,粉碎機粉碎過60目篩后按照料液比1∶10 (W/V)加入磷酸鹽緩沖液(50 mmoL/L,pH6.8),4 ℃冷凍離心機4000 r/min離心10 min,上清液即為粗酶。

1.2.1.1 磷酸鹽緩沖液pH的確定 固定料液比為1∶10 (W/V),測定各磷酸鹽緩沖液pH5.8、6.3、6.8、7.3、7.8下酪氨酸酶活力。

1.2.1.2 料液比的確定 磷酸鹽緩沖液pH由1.2.1確定,測定各冷凍土豆與緩沖液的料液比(W/V):1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12下酪氨酸酶活力。

1.2.2 酪氨酸粗酶的反應條件的確定 將3.5 mmoL/L的L-多巴1.0 mL、磷酸緩沖液(50 mmoL/L,pH6.8)2.0 mL于試管中35 ℃恒溫預熱5 min,后加入1.0 mL粗酶混勻,反應一段時間后,用紫外分光光度計測定475 nm處的吸光度[21-22]。每個樣品做三組,每組測三次,取均值。每分鐘多巴色素在475 nm波長吸光度增加0.001為一個酶活力單位,即1 U·min-1。

1.2.2.1 反應時間的確定 反應溫度35 ℃,底物L-多巴/粗酶加入量5∶5,測定反應時間:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19 min 下酶活力的變化。

1.3.2 反應溫度的確定 反應時間由1.3.1確定,底物L-多巴/粗酶加入量5∶5,測定各反應溫度:25、30、35、40、45 ℃下酶活力的變化。

1.2.2.3 底物L-多巴/粗酶加入量的確定 反應時間由1.2.2.1確定,反應溫度由1.2.2.2確定,測定各底物L-多巴/粗酶加入量:1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5、6∶5、7∶5下酶活力的變化。

1.2.3 天然植物精油對酪氨酸酶活性影響

1.2.3.1 最優天然植物精油的篩選 采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法,稍作修改[23]。按表1分別加入橘子、尤加利、杜松、冬青、桂皮、羅勒、薄荷、歐白芷、茶樹、百里香、桂花、百合、綠化白千層、依蘭、佛手柑植物精油(C=0.4 mg/mL)、L-多巴溶液(3.5 mmoL/L)、PBS(50 mmoL/L,pH6.8)及DMSO后混勻,35 ℃恒溫預熱5 min,加入按1.2.1條件下提取酪氨酸粗酶,于35 ℃水浴反應15 min,于475 nm處測定吸光度。每個樣品做三組,每組測三次,取均值,計算激活率。

表1 反應液的組成(mL)Table 1 Composition of the reaction solution(mL)

式中:A、B、C、D表示實驗中四只試管的吸光度值。

1.2.3.2 三種植物精油對酪氨酸酶的激活作用 將篩選出來的百里香、茶樹、依蘭精油與陽性對照補骨脂素分別配制成濃度為0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/mL的溶液,按表1分別加入植物精油或補骨脂素、L-多巴溶液(3.5 mmoL/L)、PBS(50 mmoL/L,pH6.8)及DMSO后混勻,35 ℃恒溫預熱5 min,加入按1.2.1.2條件下提取酪氨酸粗酶,于35 ℃水浴反應15 min,于475 nm處測定吸光度。每個樣品做三組,每組測三次,取均值,計算各濃度下激活率(同1.2.3.1)。

1.2.4 酶動力學實驗 固定酪氨酸酶的添加量,選擇不同濃度(0、1.5、3.0 mg/mL)植物精油,進行動力學實驗[24]。 按表2分別加入3.5 mmoL/L L-多巴溶液、PBS(50 mmoL/L,pH6.8)并與不同濃度植物精油(0、1.5、3.0 mg/mL)混勻后,35 ℃預熱5 min,再加酪氨酸酶在35 ℃反應15 min,于475 nm處測定吸光度,通過Lineweaver-Burk圖測定激活類型,以上測試均有兩個以上的單獨試驗并各重復3次。

表2 酶的動力學實驗反應液組成(mL)Table 2 The reaction liquid composition of enzyme kinetics experiment(mL)

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 土豆中酪氨酸粗酶的提取條件的確定

2.1.1 磷酸鹽緩沖液pH的確定 如圖1所示,酪氨酸酶活性先減少后增加再減少,酪氨酸酶在pH為6.8時酪氨酸酶活性最高,隨著pH的繼續增高,酶活性大幅度降低,在pH為7.8時酶活性幾乎喪失。pH是影響酶活性較為常見的因素,研究表明植物蛋白酶最適pH為3～10,大多數植物酶的最適pH在7左右偏酸性[25],實驗結果也顯示磷酸緩沖液在pH為6.8最為合適。

圖1 pH對酪氨酸酶活性的影響Fig.1 Effect of pH on the activity of tyrosinase注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),圖2～圖5同。

2.1.2 料液比的確定 如圖2所示,冷凍土豆與緩沖液的料液比對酶活性影響為隨著料液比的增加,酶活力呈現先增加后減少的趨勢,當料液比在1∶10時,酶活力達到最大值,繼續改變料液比酶活力仍會出現增大的現象,但考慮實際情況,料液比在1∶10最合適。

圖2 料液比對酪氨酸酶活性的影響Fig.2 Effect of material to liquid ratio of tyrosinase activity

2.2 酪氨酸粗酶的反應條件的確定

2.2.1 反應時間的確定 如圖3所示,酪氨酸酶最適反應時間13 min,在此之前酶活力不斷增加,之后酶活力趨于穩定。因為當反應13 min左右以后,L-多巴底物與酪氨酸酶幾乎反應完全,不再隨時間的增加繼續反應,與文獻報道反應時間一致[15,26]。

圖3 反應時間對酪氨酸酶活性的影響Fig.3 Effect of reaction time on the activity of tyrosinase

2.2.2 反應溫度的確定 如圖4所示,在25～45 ℃反應條件對酶活力影響較小,但當溫度低于35 ℃隨溫度的增加酶活力增大,高于35 ℃以后不斷減小,酪氨酸酶最適反應溫度為35 ℃,且超過45 ℃酶可能會失活[27],因此酪氨酸酶最適反應溫度為35 ℃。

圖4 反應溫度對酪氨酸酶活性的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the activity of tyrosinase

2.2.3 底物L-多巴/粗酶加入量的確定 如圖5所示,隨著底物L-多巴加入量/粗酶加入量比例的增大,酪氨酸酶活性逐漸上升,當比例為5∶5時,所測酪氨酸酶活力最大即酪氨酸酶活力峰值,當比例繼續增大時,酶活性開始下降,從節約成本和高效的角度考慮底物L-多巴加入量/粗酶加入量5∶5最合適。

圖5 底物L-多巴/粗酶加入量對酪氨酸酶活性的影響Fig.5 Effect of substrate L-dopa/amount of crude enzyme tyrosinase activity

綜上可知,土豆中酪氨酸酶的提取條件為磷酸鹽緩沖液pH6.8、冷凍土豆與緩沖液的料液比1∶10 (g/mL)、反應條件為反應溫度35 ℃、反應時間13 min、底物L-多巴加入量/粗酶加入量5∶5。

2.3 15種植物精油對酪氨酸酶活性影響

2.3.1 最優天然植物精油的篩選 篩選了15種天然植物精油(C=0.4 mg/mL)對酪氨酸酶活性的影響,結果如表3所示。結果顯示,植物精油可影響酪氨酸酶的活性,編號1～7各精油有抑制作用,編號8～15各精油有激活作用,百里香、茶樹、依蘭精油對酪氨酸酶有顯著的激活作用(P<0.05),因此將對其激活機理進一步研究。

表3 15種天然植物精油對酪氨酸酶活性的影響Table 3 Effect of fifteen natural plant essential oils on tyrosinase activity

2.3.2 三種植物精油對酪氨酸酶的激活作用 由圖6可知,百里香、茶樹、依蘭精油對酪氨酸酶有明顯的激活作用,且呈濃度依賴關系。表4可知,三種精油的IC50值分別為0.488、0.429、0.480 mg/mL,略低于陽性對照補骨脂素(IC50=0.328 mg/mL)。

表4 植物精油對酪氨酸酶的激活作用Table 4 Activation of tyrosinase by plant essential oils

圖6 三種植物精油對酪氨酸酶的激活作用Fig.6 Activation of tyrosinase by three plant essential oils

2.4 百里香、茶樹、依蘭精油對酪氨酸酶的動力學分析

為了進一步研究百里香、茶樹、依蘭精油對酪氨酸酶的激活機制,測試了三種不同濃度精油的Lineweaver-Burk雙倒數曲線。補骨脂素是一種常見的酪氨酸酶激活劑,為本實驗陽性對照。如圖7所示,隨著百里香精油的濃度不斷增大,Km(米氏常數)不變,Vmax(最大反應速度)逐漸減小,根據Saboury[28]對于激活類型的判斷,百里香精油為非競爭型激活,表明底物L-多巴和激活劑與酶同時結合,兩者沒有競爭作用[12]。

圖7 百里香精油對酪氨酸酶激活作用的動力學雙倒數曲線Fig.7 Lineweaver-Burk of tyrosinase activation by thyme oil

如圖8、圖9所示,茶樹、依蘭精油的三條直線相交于第二項限,隨著精油濃度增加,Km逐漸減小,Vmax不斷變小,可判斷這兩種精油為混合型激活,即競爭性激活與非競爭激活同時存在,表明底物L-多巴和激活劑與酶同時結合,激活劑與底物L-多巴競爭酶的結合位點[29]。

圖8 茶樹精油對酪氨酸酶激活作用的動力學雙倒數曲線Fig.8 Lineweaver-Burk of tyrosinase activation by tea tree oil

圖9 依蘭精油對酪氨酸酶激活作用的動力學雙倒數曲線Fig.9 Lineweaver-Burk of tyrosinase activation by ylang-ylang oil

如圖10所示,補骨脂素相交于第三項限,隨著補骨脂素濃度增加,Km逐漸減小,Vmax不斷變小,可判斷其為混合型激活。相比于陽性對照,三種植物精油對酪氨酸激活略弱,但植物精油含有疏水性化合物,對皮膚具有更高的親和力[30],這對于化妝品或食品工業可能是重要的,但是還需要深入的研究這三種植物精油的組成成分。

圖10 補骨脂素對酪氨酸酶激活作用的動力學雙倒數曲線Fig.10 Lineweaver-Burk of tyrosinase activation by psoralen

3 結論

從新鮮土豆中提取酪氨酸酶,以L-多巴為底物進行單因素分析,確定了酪氨酸酶最適提取條件為磷酸鹽緩沖液pH6.8、冷凍土豆與緩沖液的料液比1∶10 (g/mL)。酪氨酸粗酶的反應條件單因素優化中確定了最適反應溫度35 ℃、反應時間13 min、底物L-多巴加入量/粗酶加入量5∶5。

篩選了15種植物精油對酪氨酸酶活性影響,發現百里香、茶樹、依蘭精油對酪氨酸酶有顯著的激活作用,IC50值分別為0.488、0.429、0.480 mg/mL,接近陽性對照補骨脂素0.328 mg/mL。動力學實驗證明百里香精油為非競爭型激活作用,茶樹、依蘭精油為混合型激活作用。

本實驗證明百里香、茶樹、依蘭精油對酪氨酸酶有較好的激活作用,為新型安全的酪氨酸酶激活劑的開發利用打下基礎,也為植物精油的進一步利用提供實驗依據。后期將在以下幾個方面進一步研究:植物精油是由小分子組成的混合物,化學成分較為復雜,哪些成分對精油的激活作用起關鍵作用,及各成分之間是否有協同或是拮抗作用,需要進一步研究。本實驗只是對精油激活酪氨酸酶的活性及動力學方面做了研究,若用于治療疾病,還需要進行細胞及動物實驗等藥理方面的研究,進一步考察植物精油的有效性和安全性。