黃沙鱉致病性蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

黎姍梅，吳柳青，許飄尹，盛雪晴，賀曉晨，肖雙燕，邱梓晟，梁靜真，韓書煜*，黃 鈞*

(1.廣西水生動物病害診斷實驗室/廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530004；2. 廣西水產技術推廣總站，廣西 南寧 530022；3.武宣縣水產技術推廣站，廣西 武宣 545900)

【研究意義】中華鱉(Pelodiscussinensis)的地理種群黃沙鱉廣泛分布于廣西的左江、右江、郁江及西江流域[1]，具有較強的繁殖力和抗病性，易于飼養，其體色鮮黃、裙邊寬厚、肉嫩味美，是廣西名特優水產養殖品種之一。近年來，隨著黃沙鱉養殖規模的不斷擴大，其各種病害頻繁暴發[2-4]，嚴重影響廣西黃沙鱉養殖業的健康發展。2016年7月，廣西武宣縣某養殖場黃沙鱉出現表皮充血發炎、疥瘡和腐皮等多種病癥，并陸續發病死亡，疑似由蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)引起，但目前有關黃沙鱉蠟樣芽孢桿菌病的研究尚未見報道。因此，對黃沙鱉進行病原菌分離鑒定和藥物敏感性試驗，對防治黃沙鱉蠟樣芽孢桿菌病具有重要意義。【前人研究進展】蠟樣芽孢桿菌是一種需氧或兼性厭氧、具有芽孢的革蘭氏陽性桿菌，廣泛分布于自然界的空氣、水體和土壤中[5-6]，該菌抗逆性較強，能分泌抗菌素和超氧化物歧化酶等有益生物活性物質，作為微生態制劑和飼料添加劑在水產養殖領域已得到廣泛應用[7-9]。蠟樣芽孢桿菌屬于條件性致病菌，能引起人類食物中毒、傷口感染，甚至引起肺炎、腦膜炎及敗血病等嚴重疾病[10]，也能引起牛乳房炎[11]和子宮內膜炎[12]、馬表皮潰爛[13]、豬腹瀉[14]等家畜疾病，還能引起半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[15]、羅非魚(Oreochromis)[16]、棘胸蛙(Quasipaaspinosa)[17]和中華鱉[18]等水產養殖動物發病死亡。目前已知的鱉細菌性疾病有紅底板病、紅脖子病、白底板病、腐皮病、癤瘡病、白點病和愛德華氏菌病等，病原菌有遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)[19]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila[2，20]、溫和氣單胞菌(A.sobria)[21]和類志賀鄰單胞菌(Plesimonasshigelloides)[4]等?！颈狙芯壳腥朦c】目前，蠟樣芽孢桿菌作為病原菌引起爬行類動物致病僅見譚愛萍等[17]對中華鱉的報道，而關于黃沙鱉感染該菌的研究尚無報道?！緮M解決的關鍵問題】對廣西武宣縣某養殖場患病黃沙鱉進行病原菌分離鑒定及藥敏試驗，為確定引起黃沙鱉患病的病原及在生產中進行有效防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病樣為廣西武宣縣某養殖場患病黃沙鱉，平均體重1410.7 g/只，病癥為表皮充血發炎、疥瘡及腐皮等。用于人工感染試驗的健康黃沙鱉購自廣西武宣縣另一個養殖場，平均體重約116.4 g/只，試驗前在廣西大學水產教學科研基地暫養30 d，期間黃沙鱉的攝食及活動正常，生長良好，無任何肉眼可見病癥，人工感染前3 d隨機抽樣檢測均未從心臟和肝臟中分離到細菌。

普通營養瓊脂培養基、腦心浸液培養基和兔血瓊脂培養基均購自北京陸橋技術有限責任公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；新霉素、多西環素和恩諾沙星原料藥購自浙江國邦藥業有限公司；API 20E和API 50CH生化鑒定試劑條及所需配套試劑均購自法國梅里埃公司；PCR擴增試劑盒購自寶日醫生物技術(北京)有限公司。

1.2 細菌分離

先對患病黃沙鱉外觀癥狀進行檢查并記錄，然后采用常規方法對病樣進行解剖，肉眼觀察并記錄其腸道、胃、心臟、肝臟和咽喉等各內臟器官的病變情況。用75 %酒精棉球對肝臟、腎臟和脾臟等器官的取樣部位進行擦拭，并取樣劃線接種于普通營養瓊脂培養基上，37 ℃恒溫培養18～24 h，挑取優勢菌落進行純化培養后置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3 人工感染試驗

1.3.1 無菌濾液人工感染試驗 按韓書煜等[21]的方法，取患病黃沙鱉的心臟、肝臟、腎臟和脾臟等內臟組織勻漿，10 ℃下10 000 r/min離心30 min后取上清液，采用0.22 μm細菌濾器過濾得到無菌濾液，涂布于普通營養瓊脂培養基上觀察是否有菌落生長。取健康黃沙鱉分成對照組和試驗組，每組20只。對照組和試驗組分別腹腔注射滅菌PBS和無菌濾液，每只注射量均為0.5 mL，各組均設3個平行，然后進行15 d的飼養觀察。若發生死亡現象即取剛死或瀕死個體內臟組織再制成無菌濾液并進行人工感染試驗。

1.3.2 分離菌株的人工感染試驗 用滅菌PBS配制分離菌株的菌懸液，以細菌比濁儀將細菌濃度調為5.07×107CFU/mL。取健康黃沙鱉分成對照組和試驗組，每組20只。試驗組腹腔注射菌懸液0.5 mL/只，對照組注射等量的滅菌PBS，各組均設3個平行。注射后分別飼養于相同條件的不同水族箱中，連續觀察15 d。按照1.2的方法對具有與自然患病癥狀相似的瀕死個體進行生化分離。第2次人工感染試驗步驟與第1次相同，所注射的菌懸液(4.95×107CFU/mL)為第1次人工感染試驗分離純化得到的細菌制備而成。

1.4 細菌鑒定

1.4.1 生化鑒定 將活化后的菌株分別劃線接種于普通營養瓊脂培養基和兔血瓊脂培養基，培養24 h后觀察菌落的顏色、形態和溶血性，經革蘭氏染色后觀察細菌的形態特征。根據染色結果和細菌形態選擇API 50CH試劑條、API 50CHB培養基和API 20E試劑條(前12個項目)進行生化鑒定。利用APIWEB服務器(https://apiweb.biomerieux.com/login)的API 50CHB V4.0對鑒定結果進行判斷。

1.4.2 分子生物學鑒定 對GXWXAA菌株的16S rRNA序列進行PCR擴增。按黃鈞等[3]的方法提取細菌基因組DNA，-20 ℃保存備用。PCR擴增使用的上游引物為8F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、下游引物為1492R(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。 反應體系25.0 μl：TaqMix 12.5 μl，ddH2O 8.5 μl，10 μmol/L上下游引物各1.0 μl，DNA模板2.0 μl。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，進行30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物送至深圳華大基因科技有限公司測序。

1.5 藥敏試驗

參照黃艷華等[2]的方法進行K-B紙片擴散法操作，按生產廠家提供的標準進行判斷；最小抑菌濃度(MIC)采用二倍稀釋法進行測定。根據K-B紙片擴散法的試驗結果選用恩諾沙星、新霉素和多西環素進行MIC測定；參照黃新財等[22]的方法，用滅菌PBS將藥物配制成1000 μg/mL母液；在無菌條件下，向96孔微量板每孔分別加入120 μl腦心浸液培養基，向第1孔加入母液120 μl，用移液槍混勻后取120 μl移至第2孔中，混勻后再取120 μl移至第3孔中，依次類推，直至第14孔吸取120 μl混合液并棄去，最后向每孔中加入1.2×108CFU/mL菌懸液120 μl。至此，第1～14孔中抗生素終濃度分別為250.00、125.00、62.50、31.30、15.60、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.24、0.12、0.061和0.031 μg/mL。設一個不加菌液的藥物為空白對照組和一個加菌液不加藥液的陽性對照。30 ℃下培養48 h后，以用肉眼觀察無細菌生長第1個孔的藥物濃度為該藥物對受試菌株的MIC。MIC按美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)2017版微生物藥物敏感性試驗的執行標準判斷。

2 結果與分析

2.1 患病黃沙鱉的臨床癥狀

觀察發現，病鱉行動緩慢、四肢無力；底板充血發炎，有疥瘡和腐皮等癥狀，裙邊潰爛發炎，頸部充血腫大。解剖可見腹部有大量淡紅色腹水，腸道充血發炎，肝臟發黑變硬(圖1)。

2.2 病原菌分離結果

從病鱉的肝臟中分離獲得1株優勢菌株，編號為GXWXAA。該菌株為革蘭氏陽性桿菌，兩端鈍圓，平均約1.0 μm×4.0 μm，呈單個或鏈狀排列；具有芽孢，芽孢呈卵圓形，位于菌體中央或近端，芽孢小于菌體橫徑，不突出于菌體外。在普通營養瓊脂培養基30 ℃培養24 h后，菌落直徑約1.64 mm，呈乳白色，表面不透明，粗糙似蠟狀，邊緣不平整；在兔血瓊脂培養基上培養24 h后呈明顯的β-溶血(圖2)。

2.3 人工感染試驗結果

2.3.1 無菌濾液的人工感染試驗結果 涂布在普通營養瓊脂培養基上的無菌濾液在37 ℃經24 h培養未觀察到菌落生長。注射無菌濾液和滅菌PBS緩沖液的黃沙鱉經15 d連續觀察，活動和攝食正常，均未出現病癥或死亡。據此認為廣西武宣縣某養殖場黃沙鱉患病由病毒引起的可能性較小。

2.3.2 分離菌株人工感染試驗結果 以菌株GXWXAA制備菌懸液進行第1次人工感染試驗，分離純化得到的菌株命名為GXWXAA1；以GXWXAA1制備菌懸液再進行第2次人工感染試驗，分離純化得到的菌株命名為GXWXAA2。從圖3可看出，2次人工感染試驗(GXWXAA和GXWXAA1的菌懸液濃度分別為5.07×107和4.95×107CFU/mL)的第2天(注射后第2天)黃沙鱉開始死亡，第2～3天為死亡高峰期，至第5～6天全部死亡，死亡率均為100.0 %，而注射滅菌PBS組觀察15 d均無黃沙鱉死亡現象，活動及進食均正常，無任何病癥。說明GXWXAA和GXWXAA1菌株對黃沙鱉均具有較強的致病力。

圖1 患病黃沙鱉的主要臨床癥狀Fig.1 Main symptoms of diseased Huangsha turtle

圖2 黃沙鱉病原菌株GXWXAA的革蘭氏染色結果、菌落形態和溶血性Fig.2 Gram staining morphology，colony morphology and hemolysis of strain GXWXAA of Huangsha turtle

在第1次人工感染試驗中，大部分黃沙鱉出現反應遲緩和不攝食等現象，解剖后可見部分黃沙鱉的喉部有潰瘍，腹腔有不同程度的腹水和腸道發炎，底板輕微發紅，外觀與自然患病黃沙鱉的癥狀基本吻合；第2次人工感染試驗受試黃沙鱉的癥狀與第1次人工感染試驗基本一致(圖4)，且2次人工感染試驗分離到的菌株GXWXAA1和GXWXAA2的菌落和菌體形態與自然患病鱉分離的菌株GXWXAA一致，說明GXWXAA是引起廣西武宣縣某養殖場黃沙鱉發病死亡的病原菌。

2.4 細菌生化鑒定結果

使用API 50CH試劑條、API 50CHB培養基和API 20E試劑條(前12個項目)進行細菌生化鑒定，結果(表1～2)表明，菌株GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2的生理生化特征一致。經APIWEB服務器的API 50CHB V4.0分析，菌株GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2均鑒定為蠟樣芽孢桿菌，置信度為99.0 %。

圖3 2次人工感染試驗黃沙鱉的累計死亡率Fig.3 Total mortality rate of double batches of artificial infection of Huangsha turtle

左：底板輕微發紅；中：第1次人工感染試驗黃沙鱉解剖圖；右：第2次人工感染試驗黃沙鱉解剖圖Left：slight rubedo of plastron；Centre：anatomical figures of Huangsha turtle in the first artificial infection test；Right：anatomical figures of Huangsha turtle in the second artificial infection test圖4 人工感染試驗黃沙鱉的解剖癥狀Fig.4 Anatomical symptoms of Huangsha turtle in the artificial infection test

表1 菌株GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2的API 50CH鑒定結果Table 1 Results of API 50CH identification of GXWUAA,GXWXAA1 and GXWXAA2 strains

注：“-”和“+”分別表示反應為陰性和陽性，下同。

Note:‘-’ and ‘+’ represented negative and positive reaction，respectively，the same as below.

表2 菌株GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2的API 20E鑒定結果Table 2 Results of API 20E identification of GXWUAA，GXWXAA1 and GXWXAA2 strains

2.5 分子生物學鑒定結果

對菌株GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2的16S rRNA序列進行PCR擴增，均獲得約1500 bp條帶(圖5)。測序結果表明，GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2間的序列相似性均為100.0 %。基于16S rRNA序列相似性構建系統發育進化樹(圖6)，結果發現菌株GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2與蠟樣芽孢桿菌JY5 (HQ833024)、JY7 (HQ833025)、JY9 (HQ833026)和VBE16(MG027671)聚為一支，親緣關系最近，相似性均為99.9 %；與大腸桿菌U5/41 (NR_024570)的親緣關系較遠，相似性均為76.6 %。綜合生化鑒定結果(表1和表2)和分子生物學鑒定結果，確定菌株GXWXAA、GXWXAA1和GXWXAA2為蠟樣芽孢桿菌。

1：菌株GXWXAA；2：菌株GXWXAA1；3：菌株GXWXAA2；M：DL2000 DNA Marker；N：陰性對照1：Strain GXWXAA；2：Strain GXWXAA1；3：Strain GXWXAA2；M：DL2000 DNA Marker；N：Negative control圖5 16S rRNA序列的PCR擴增結果Fig.5 PCR amplification result of 16S rRNA sequence

圖6 基于16S rRNA序列相似性構建的系統發育進化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences similarity

2.6 藥敏試驗結果

由表3可知，菌株GXWXAA對各種抗生素的敏感性各不相同，其中對新霉素、恩諾沙星和多西環素等15種抗生素敏感，對頭孢曲松、環丙沙星和依諾沙星中介，對青霉素G、氨芐青霉素、復達欣、復方新諾明和多粘菌素B耐藥。MIC試驗結果(表4)表明，菌株GXWXAA對多西環素、新霉素和恩諾沙星均敏感，其MIC排序為新霉素>多西環素>恩諾沙星，與K-B紙片擴散法的判斷結果(表3)一致。

表3 菌株GXWXAA的藥物敏感性試驗結果(K-B紙片擴散法)Table 3 Results of antibiotic sensitivity test of strain GXWXAA(K-B disc diffusion test)

注：S表示敏感；I表示中介；R表示不敏感，下同。

Note:S indicates sensitive；I indicates moderately sensitive；R indicates resistant，the same as below.

表4 3種藥物對菌株GXWXAA的最小抑菌濃度(μg/mL)Table 4 Minimum inhibitory concentration of three kinds of antibiotics against strain GXWXAA

3 討 論

廣義的蠟樣芽孢桿菌被稱為蠟樣芽孢桿菌群，包括蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、炭疽芽孢桿菌(B.anthraci)和蕈狀芽孢桿菌(B.mycoides)等，這幾種細菌DNA的同源性較高，形態和生化特征較相近[23]。目前，國內外對蠟樣芽孢桿菌的鑒定方法包括生化鑒定和分子生物學鑒定等[24]。本研究從患病黃沙鱉肝臟中分離到1株菌株GXWXAA，經人工感染試驗供試健康黃沙鱉感染死亡率達100.0 %；可觀察到與自然病癥相似的癥狀，且從感染發病黃沙鱉內臟分離到與菌株GXWXAA形態、分子和生理生化特征一致的菌株，表明菌株GXWXAA是導致武宣縣某養殖場黃沙鱉患病死亡的致病菌；通過革蘭氏染色和形態特征分析發現，菌株GXWXAA為具有芽孢的革蘭氏陽性菌；基于16S rRNA序列的系統發育進化樹和相似性分析結果可知，菌株GXWXAA與蠟樣芽孢桿菌JY5、JY7、JY9和VBE16聚為一支，相似性均為99.9 %。綜合細菌形態特征、生理生化特征及16S rRNA序列分析結果，GXWXAA菌株鑒定為蠟樣芽孢桿菌。

蠟樣芽孢桿菌在自然界分布廣泛，已廣泛應用于對養殖水質控制[8-9]。但近年來的研究表明，蠟樣芽孢桿菌對養殖動物和人類產生了廣泛的危害，除可導致奶牛[11]、馬[13]、豬[14]、半滑舌鰨[15]、羅非魚[16]、棘胸蛙[17]、中華鱉[18]和家蠶(Bombyxmori)[25]等多種養殖動物發病死亡外，還可引起人類的眼疾、敗血癥和心腦膜炎等疾病[10]，因此，需高度關注其致病機理研究。動物感染蠟樣芽孢桿菌后表現出的癥狀因種類不同而存在明顯差異。仔豬感染主要表現生長不良、消瘦和腹瀉[14]；家蠶感染主要表現上吐下瀉和中腸破裂，死亡率達100.0 %[25]；羅非魚人工感染后主要表現離群獨游、肛門紅腫、體表充血和腎充血發黑等，死亡率達60.0 %[16]；馬感染后表現皮膚發生膿腫潰瘍[13]；棘胸蛙感染后表現頭部真皮層腐爛、肝充血淤血，反應變慢、食欲減退[17]；半滑舌鰨感染主要表現皮膚充血潰爛、腹部紅腫[15]；中華鱉感染后表現癥狀包括腹甲有出血斑、頸部充血腫大、四肢無力、反應遲鈍等[18]。本研究中，蠟樣芽孢桿菌感染引起黃沙鱉發病的臨床癥狀主要為底板充血發炎、疥瘡和腐皮，裙邊潰爛發炎，頸部充血腫大，腹腔中有大量腹水，腸道充血發炎，肝臟發黑變硬等，與上述文獻報道其他動物的部分發病癥狀相似，其中包括行動緩慢、腐皮、腸道發炎和腹水等。細菌通常是通過傷口進入機體，經血液循環或淋巴循環引起各臟器等全身性感染[13]，推測本研究中蠟樣芽孢桿菌對黃沙鱉的感染可能也與表皮受損有關。致病性蠟樣芽孢桿菌通常攜帶腹瀉型腸毒素，如溶血素BL、非溶血性腸毒素Nhe、細胞毒素CytK、腸毒素T、腸毒素HlyⅡ及嘔吐型毒素等，而這些毒素能引起人類或動物腹瀉或嘔吐型腸道疾病[14，25]。根據本研究中黃沙鱉的發病癥狀和分離菌株GXWXAA的溶血性推測，菌株GXWXAA可能攜帶有溶血素BL等腸毒素，從而引起黃沙鱉大量死亡。已知的蠟樣芽孢桿菌包括有益菌和致病菌，建議生產上加強對含蠟樣芽孢桿菌的微生態制劑或飼料添加劑進行相關致病基因攜帶情況檢測和監控，避免因使用存在致病性菌株而對養殖造成人為的疾病傳播、流行和損失，同時建議養殖戶控制黃沙鱉的養殖密度，防止黃沙鱉相互撕咬造成表皮受損而感染病原。

目前，抗生素仍是防控龜鱉細菌性疾病的主要手段。本研究對菌株GXWXAA進行藥敏檢測，結果表明該菌株對新霉素等15種抗生素敏感，對頭孢曲松等3種抗生素中介，對青霉素G等5種抗生素耐藥，與黃俊云等[26]對44株醫院臨床標本的蠟樣芽孢桿菌的藥敏試驗結果(對頭孢唑林、氨芐西林、青霉素和復方新諾明的耐藥率較高，對氧氟沙星和慶大霉素敏感率較高等)相似，但與其他來源蠟樣芽孢桿菌的藥敏試驗結果存在差異，如菌株GXWUAA對多西環素、鏈霉素和頭孢拉定敏感，對頭孢曲松中介，而中華鱉源蠟樣芽孢桿菌JY2、JY5、JY7和JY9對頭孢拉定和頭孢曲松均為耐藥[18]，羅非魚源蠟樣芽孢桿菌FJLF對鏈霉素中介、對多西環素耐藥[16]等?？梢?，不同地區不同動物來源的蠟樣芽孢桿菌其藥物敏感性不完全相同，可能與各地區養殖戶的用藥習慣不同有關。本研究還檢測了菌株GXWXAA對多西環素、新霉素和恩諾沙星的MIC，結果顯示菌株GXWXAA對這3種國標漁藥均為敏感，與K-B紙片擴散法檢測結果相符，可為給藥劑量的確定提供參考依據。已有學者對鯉科魚類給藥劑量和病原菌MIC的關系進行研究，發現鯉科魚類理想的給藥劑量為分離菌MIC的8.1倍[27]，但本研究未針對黃沙鱉源蠟樣芽孢桿菌的MIC確定給藥劑量，有待進一步研究確定。建議在黃沙鱉養殖生產過程中不使用抗生素預防疾病，發生病情時應基于藥敏試驗結果選擇內服敏感抗生素治療，避免使用低濃度抗生素或長期使用同種抗生素[3，22，28]，以免誘導細菌產生耐藥性。

4 結 論

引起廣西武宣縣某養殖場黃沙鱉發病的病原菌屬于蠟樣芽孢桿菌，建議選擇新霉素、恩諾沙星和多西環素等抗生素對患病黃沙鱉拌飼料內服進行治療。