山西樺褐孔菌的鑒定與固態發酵初步研究

李艷婷，徐莉娜，郭霄飛，朱 敏，南曉潔，李銀生，郭 尚*

(1.山西省農業科學院 食用菌研究所，山西 太原 030031；2.山西省太原市陽曲縣農業農村局，山西 太原 030100)

【研究意義】樺褐孔菌，Inonotusobliquus(Fr.)Pilat，屬擔子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymeno-mycetes)、銹革孔菌目(Hymenochaetales)、銹革菌科(Hymenochaetaceae)、褐臥孔菌屬(Inonotus) (=纖孔菌屬)，異名斜纖孔菌、斜生纖孔菌、樺癌孔菌、白樺茸、茶卡、和薔甘等[1]。樺褐孔菌受到全世界的廣泛關注是從1968年前蘇聯諾貝爾文學獎獲得者Aleksandr Isayevich的小說《癌病房Rakovy Kovpus》而開始的[2]。近年來，樺褐孔菌作為一種珍貴藥用真菌，因具有調節血糖血脂、抗腫瘤、抗氧化、調節、抗炎、保肝、調節免疫等作用[3]，逐漸引起越來越多國內學者的關注。【前人研究進展】樺褐孔菌主要分布在北半球北緯40°～50°的地區，如北美(北部)、芬蘭、波蘭、俄羅斯、日本等國家和地區[4-5]。在我國，樺褐孔菌主要分布在位于黑龍江、吉林和內蒙古自治區的大興安嶺、小興安嶺和長白山地區[6-11]。山西省農業科學院食用菌研究所郭尚勞模創新工作室在山西省方山縣的關帝山(呂梁山南段)也發現有大量的樺褐孔菌分布，當地還成立有專門的公司進行樺褐孔菌的粗加工及銷售。根據戴玉成和范宇光[12-13]的調查，樺褐孔菌在我國屬于稀有和瀕危類型。樺褐孔菌的野生資源匱乏，人工栽培雖有成功報道，但尚未實現規模化生產[14-18]。【本研究切入點】本文首次報道了山西樺褐孔菌的相關研究。通過對采自山西呂梁山南段的樺褐孔菌進行形態特征分析、分子生物學鑒定、品質鑒定，同時還選用了山西常見的小米、小麥、藜麥、黃豆、大豆、蕎麥、燕麥、玉米、薏米和大米共十種雜糧谷物作為發酵基質，對采自山西的樺褐孔菌分離得到的菌絲體進行谷物固態發酵，并明確樺褐孔菌在這十種雜糧谷物中的發酵特點。【擬解決的關鍵問題】通過了解其生長特性以獲得最優質的發酵產物，為這一特殊的野生資源的開發與利用提供基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株來源：本課題組在2017年10月于山西呂梁山脈的關帝山(北緯37.5°，東經111.2°)采集到樺褐孔菌，標本編號IOSF373816。將采集的樺褐孔菌菌核進行組織分離得到純菌株，保存在山西省農業科學院食用菌研究所菌種庫。

品質鑒定試劑：葡萄糖，Agar，酵母膏，HNO3，H2O2，KH2PO4，K2HPO4，MgSO4·7H2O，元素標準溶液(1000 μg/L)，超純水、蒸餾水、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、過硫酸鉀等，均為分析化學純。

固態發酵材料：山西產小米、小麥、黃豆、玉米、薏米、燕麥、藜麥、蕎麥、大豆和大米，要求顆粒飽滿、無雜質、無蟲蛀。

1.2 試驗方法

1.2.1 分離純化 選取新鮮的樺褐孔菌菌核，去除表面雜質，75 %酒精清洗其外表面3 次，置于無菌燒杯中待用。PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH自然[19]。采用組織分離法進行分離。在無菌條件下，切取5 mm×5 mm的菌核組織塊接入裝有PDA培養基的試管內，置于25 ℃[12]恒溫箱中倒置培養。培養過程中主義觀察，如有污染及時檢出。待菌絲長滿試管斜面后，置4 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 形態鑒定與分子生物學鑒定 肉眼觀察標本的顏色、質地、形狀、生長年限、平伏或有菌蓋，菌蓋是否有毛或環帶等特征，然后用標尺測量子實體的長度、寬度和厚度。

將純菌株培養，CTAB法提取菌絲DNA；ITS片段進行PCR擴增。引物序列如下：ITS 1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ )ITS 4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ )。 PCR反應體系(25 μl)：10×PCR buffer 2.5 μl、TaqDNA 酶0.3 μl、Mg2+(25 mmol/L)2 μl、dNTP 0.3 μl、引物ITS 1/ITS 4各0.7 μl、DNA模板1 μl、ddH2O 17.5 μl。PCR反應程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min；54 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min；72 ℃延伸10 min；共35個循環。然后再經過PCR產物瓊脂糖凝膠電泳、PCR產物的回收、PCR產物序列測定，用NCBI Blast程序將拼接后的序列文件與NCBI ribosomal RNA sequence(Bacteriaand Archaea)數據庫中的數據進行比對，與待測菌種序列相似性最大的菌種，即為鑒定結果[20-21]。

1.2.3 品質鑒定 粗多糖：苯酚-硫酸法[22]；β-葡聚糖：GB5009.5-2010第一法[23]；抗氧化活性：粗多糖清除DPPH自由基能力[24]；粗蛋白：凱氏定氮法[25]；三萜類化合物：參照DB44/T 496-2008[25]；總黃酮：紫外分光光度法[26]；微量元素：ICP-AES法[27]。

1.2.4 固態發酵試驗 ①谷物培養基制備。浸煮：所需谷物稱量，去除雜物，浸煮各谷物，并撈出攤于地面上晾干(水分含量約40 %)。配料分裝與滅菌：將浸煮好的谷物分裝至玻璃瓶中，每瓶濕重約150 g，121 ℃高壓滅菌2 h。 ②接種。滅菌的谷物培養基放涼后，按無菌操作要求，挑取帶PDA培養基的的斜面菌種(0.5 cm×0.5 cm)，接至谷物培養基中央。③培養與觀察。 25 ℃黑暗培養[12]。發酵過程中，定期觀察記錄菌絲生長情況。并每隔7 d測量樺褐孔菌菌絲在瓶內生長的長度。

2 結果與分析

2.1 樺褐孔菌形態特征

子實體呈塊狀，在樹干上形成大小不等的團狀物，菌核。菌核呈瘤狀物、黑褐色或黑色，有不規則溝痕，內部呈棕色或黃褐色，直徑為20～30 cm，表面很硬，干時脆。菌肉木柱質，有模糊不清的環紋，淡黃色。

圖1 分離菌株的ITS序列Fig.1 ITS sequences of isolated strain

2.2 樺褐孔菌分子生物學鑒定

將測序獲得的ITS序列與NCBI數據庫收錄序列(NCBI No. MH150820.1)進行比對分析，證明兩者為同屬同種，證明本試驗所使用的菌種準確無誤，保證材料的真實性(圖1)。

2.3 品質鑒定

呂梁山樺褐孔菌菌核多糖含量極高，達到4.01 g/100g，其中的β-葡聚糖含量為6.25 mg/g；蛋白質含量2.82 g/100g；三萜類化合物0.74 %，黃酮含量4.9 mg/100g ，DPPH自由基清除抗氧化活性為93.90 %。有益礦物元素從高到低為K、Mg、Ca、Fe、Mn、Na、Zn，含量依次為40 532.4、2924.0、2824.2、1200.8、164.3、127、116.0 mg/kg。

2.4 樺褐孔菌固態發酵

2.4.1 樺褐孔菌在不同谷物培養基質上的發酵情況 樺褐孔菌在這十種谷物基質中均能發酵(表1)，萌發時間相同，都為1 d；在燕麥和薏米基質中發酵最快，菌絲生長速度分別為3.02和2.39 mm·d-1，且菌絲濃密程度都是較密，菌絲均為潔白(圖2)；黃豆和大米中發酵速度次之，其生長速度菌在2 mm·d-1左右，無顯著性差異，但大米中的樺褐孔菌菌絲致密程度欠佳且顏色發黃；在小麥和小米中菌絲生長速度分別為1.64和1.79 mm·d-1，小麥中的菌絲濃密潔白，但小米中的菌絲體顏色發黃且濃密程度與小麥相比欠佳。

在大豆中生長雖慢，菌絲生長速度為1.09 mm·d-1，但菌絲非常濃密，顏色潔白；而在藜麥和蕎麥基質中，發酵初期菌絲比較濃密，顏色呈潔白，而到發酵后期則菌絲呈現黃色。樺褐孔菌在玉米中的發酵表現最為不佳，不僅生長慢且菌絲稀疏，全程菌絲發黃。

表1 樺褐孔菌在10種谷物培養基中的發酵情況Table 1 Fermentation of Inonotus obliquus in 10 grain media

注：+++表示菌絲濃密，++表示菌絲較密，+表示菌絲稀疏；同列不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Mycelium apparent density was classified as +++ (= dense), ++ (= soft), + (= faint); Values in the same column with different superscripts are significantly different (P<0.05).

圖2 樺褐孔菌在各培養基質上的發酵情況Fig.2 Growth of Inonotus obliquus at the different stages of grain fermentation

在發酵試驗中，發酵滿瓶時間最短的是燕麥，僅需5 d即可完成；薏米和大米需要7周；小麥、玉米、黃豆和小米次之，為8周；蕎麥和大豆基質中發酵時間是10周；藜麥完成發酵時間最長，長達到15周時間，并且由于發酵時間過長，菌絲已發黃老化。

2.4.2 樺褐孔菌谷物發酵過程中不同階段的菌絲生長量 如圖3所示，樺褐孔菌在十種谷物發酵過程中的不同階段，其菌絲生長趨勢基本一致，發酵菌絲在接種后2～4周內長滿基質上表面并開始縱向向下生長，其中菌絲蓋面時間為2周的是薏米、大米和小米，菌絲蓋面時間為3周的是小麥、玉米、黃豆、藜麥和燕麥，而在大豆和蕎麥基質中的菌絲蓋面時間分別為4和5周，從第5和6周才菌絲才開始向下縱向生長。

在薏米、大米和小米中3種培養基中，前3周的菌絲生長長度分別為58.5、47.8、58.3 mm，薏米和大米培養基中7周發酵完成，小米培養基中8周完成發酵。綜合計算，樺褐孔菌在薏米和小米固態發酵過程中前五周菌絲的生長長度分別為95.1和84.1 mm，分別占到總量的95.1 %和87.9 %；大米基質中，發酵前5周菌絲生長長度是99.3 mm，占到總量的98.9 %。

在燕麥、小麥、黃豆3種培養基中，前4周的菌絲生長長度分別為58.5、47.8、58.3 mm，小麥和黃豆培養基中8周發酵完成，而燕麥中僅需要5周時間。燕麥在第5周的菌絲生長長度僅有3.1 mm，前4周的菌絲生長量占到總生長量的96.8 %；在小麥培養基中，第6、7、8周的菌絲生長量分別為9、13.5、10 mm；在黃豆培養基中，發酵完成時間為7周，在第7和8周的菌絲生長量分別為5.3、1.3 mm，因此，前6周的菌絲生長量占到總生量的93.1 %和98.6 %。

在玉米基質中，8周完成發酵。前3周其菌絲生長量依次降低，分別是9.6、8.3和6.7 mm，到第4周時達到峰值37.8 mm，隨后又依次降低，到第8周時菌絲生長量只有5.75 mm，因此，樺褐孔菌在前7周的菌絲生長量占到了總量的94.5 %。

在大豆和蕎麥培養基中，均為10周發酵完成。大豆培養基中前5周的菌絲生長量為49.8 mm，而6周以后每周的生長量分別為8、4.9、4.1和3 mm，分別占到了總生長量的10.2 %、6.22 %、5.2 %和3.8 %；蕎麥培養基中前5周菌絲生長量依次降低，在第6周達到高峰值，為46.798 mm，而后又依次降低，在第9周和第10周的菌絲生長量分別降到了3.14和3.28 mm，分別占到了菌絲總生長量的3.17 %和3.31 %。

在藜麥培養基中，樺褐孔菌15周才能完成發酵。前3周的菌絲生長量較小，只有15.3 mm，在第4周菌絲生長量達到峰值，為26.86 mm，隨后幾周一直保持在5 mm左右(第6周例外，為11 mm)，前6周菌絲生長量占總量的61.4 %，前8周菌絲生長量占總量的72.6 %，直到第15周發酵即將完成時，菌絲生長量降到了3 mm，達到最低值，占到菌絲總量的3.1 %，綜合來看，后9周的菌絲生長量占到總量的38.6 %，而后7周僅占到27.4 %。

3 討 論

樺褐孔菌是一種藥用價值很高的、含有很多特殊功能成分的多年生大型真菌，可用于治療各種消化道癌癥、降血糖、防治艾滋病、抗衰老、降血脂、降血壓，還能夠改善過敏體質，增強免疫力[28]，目前對樺褐孔菌的生物活性成分以及功能效用的研究較多[12]。而對于食品應用領域的深度開發利用較少。雖然有一些例如樺褐孔菌多糖保鮮劑，樺褐孔菌的中藥渣固體發酵，保健飲料研制，多糖口服液等，但是這些報道多數是關于樺褐孔菌的生物活性成分的研究，將樺褐孔菌的功能成分與風味物質經過發酵培養，融合制成具有人們喜歡的風味，同時又具有特效功能的食品原料，定會為健康飲食生活帶來更好的前景。

圖3 樺褐孔菌谷物發酵過程中不同階段的生長情況Fig.3 Growth of Inonotus obliquus at the different stages of grain fermentation

樺褐孔菌主要集中分布在我國黑龍江、內蒙古和吉林地區的大興安嶺、小興安嶺和長白山。潘學仁等1996年于大興安嶺阿里河林區進行了森林真菌資源調查，在活樺樹干上發現樺褐孔菌[23]。畢湘虹等2003-2005年從生態學角度對黑龍江省小興安嶺天然紅松林林內的大型真菌進行了較全面的調查和研究，發現了在豐林國家自然保護區、涼水自然保護區和大海林林業局的紅松闊葉混交林中有數量較多的樺褐孔菌，而紅松云冷杉針葉混交林中則沒有發現[24]。張躍華等從2003-2008年對位于黑龍江省東部地區小興安嶺南麓的大亮子河國家森林公園和臨近的黑金河和腰營林場的野生大型經濟真菌資源進行了全面、系統的調查，發現在紅松闊葉混交林中同樣也存在數量較多的樺褐孔菌，而紅松云冷杉針葉混交林中則沒有發現[25]。孫亞紅等在地處大興安嶺北段的內蒙古根河市也發現了樺褐孔菌分布[26]。張春鳳等在黑龍江省和吉林省的汪清、延吉、長白山、敦化都采集到了樺褐孔菌[27]。趙俊[12]等在1997年考察長白山木腐菌時發現，樺褐孔菌在長白山區只發生在海拔較高的活樺樹上，特別是成熟樹上。

近年來，本團隊在山西省關帝山區(北緯37.5°，東經111.2°)的樺樹上發現了樺褐孔菌(NCBI登錄號MH150820.1)，是目前發現的生長在最南地區的種類。在本研究中，通過對采集自該地區的樺褐孔菌進行形態特征和環境條件的進行了分析，與大興安嶺的樺褐孔菌相比，形態特征相似，環境條件差異較大。通過測定山西樺褐孔菌的一些營養成分和化學成分含量等，發現多糖含量達4.01 g/100g，與大興安嶺的樺褐孔菌相比，超過其73.59 %，蛋白質含量為2.82 g/100g，低于大興安嶺樺褐孔菌；山西樺褐孔菌富含多種無機礦質元素，包括K、Mg、Ca、Fe、Mn、Na、Zn等20余種，其中K含量為40 532.4 mg/kg ，超過大興安嶺的樺褐孔菌93.1 %。可見采自山西呂梁山脈關帝山區的樺褐孔菌是多糖含量與鉀含量極高的一個種類。通過組織分離得到了試驗用山西樺褐孔菌的純菌株，經分析其ITS序列，并進行了比對，相似性結果為100 %，證明為同種，保證了下一步樺褐孔菌谷物發酵使用菌種的準確性。

樺褐孔菌屬稀有和瀕危物種，野生資源極度匱乏，人工栽培雖有成功報道，但尚未實現規模化生產[6-10]。樺褐孔菌具有重要的藥用功能，其發酵產物也具有多種保健作用，如抗腫瘤作用，抗氧化作用，降血糖作用，免疫調節作用等[29-34]，因此，采用樺褐孔菌菌絲體代替其菌核進行開發利用，不僅可以有效利用其功能成分，還能達到降低生產成本、減少野生資源破壞的效果。

谷物營養價值較高，深受人們喜愛。山西省小雜糧資源品種豐富、產品品質上乘、種植面積大且種類齊全，在國內外享有“小雜糧王國”之稱，并以其獨特的風味和營養保健功能備受現代人青睞。采用絲狀真菌發酵谷物，可以提高其營養成分含量。通過對山西樺褐孔菌菌絲體在山西部分特色雜糧谷物中進行固態發酵培養，利用培養過程中真菌菌絲的發酵作用平衡雜糧谷物的營養成分，發酵產物經過烘干與粉碎，其中不僅包含有雜糧谷物原有的豐富的營養物質和菌絲體的功能性成分，還含有菌絲體通過發酵產生的多種酶類和代謝產物。這些都是生產功能食品(如面包、蛋糕、餅干)的好原料[35]。

在谷物固態發酵試驗中，選用10種基質，分別是小麥、玉米、黃豆、藜麥、蕎麥、薏米、燕麥、大豆、大米和小米，樺褐孔菌孔菌在這10種基質中均能進行固態發酵，即這10種固態發酵產物均可作為“樺菌谷物食品原料”。谷物固態發酵滿瓶時間依次為8、8、8、15、10、7、5、10、7和8周；菌絲體總體生長趨勢基本保持一致，均是前幾周菌絲的生長量及生長速度一次降低，中間達到一個高峰值，后幾周又依次降低；同一種谷物基質中每周菌絲體生長速度存在顯著的差異。在藜麥基質中發酵最慢，發酵時間長達15周，且菌絲長勢不好。在接種后的前八周時間里，菌絲生長量占到總量(滿瓶菌絲長度)的72.6 %；蕎麥、大豆基質次之，滿瓶時間均為10周，但其菌絲長勢最好，在接種后的前八周時間里，菌絲生長量占總量的91 %～94 %；在小麥、玉米、黃豆和小米基質中，發酵滿瓶時間為8周，小麥中后3周菌絲生長量保持在10 mm左右，玉米中最后一周的生長量為5.75 mm，而黃豆培養基中后兩周的生長量只有5.3、1.3 mm，前6周占到總量的93.1 %，小米中前5周的菌絲生長量占到總生長量的87.88 %；在薏米和大米基質中，發酵滿瓶時間為7周，薏米前5周菌絲生長量占到總生長量的95.1 %，大米前6周占到了98.9 %；在燕麥基質中5周完成發酵，前4周菌絲生長量占到總生長量的96.8 %。

在制備“樺菌谷物食品原料”時，能充分利用樺褐孔菌在各谷物發酵中不同生長階段的特點，選擇好固態發酵所需谷物的裝量和各谷物需要的發酵時間，以達到減少生產投入、降低生產成本的目的。以本次試驗為例，樺褐孔菌的藜麥發酵可以在裝料時選擇谷物量為原重量(濕重150 g)的72.6 %，即108.9 g，當發酵至8周時結束發酵；樺褐孔菌的小米發酵可以在裝料時選擇谷物量為原質量的87.88 %，即131.8 g，當發酵至5周時結束發酵；樺褐孔菌在蕎麥、大豆發酵時可選擇谷物裝量為136～141 g，當發酵至8周時結束發酵；玉米發酵可選擇裝量150 g，當發酵至8周時結束發酵；黃豆發酵可裝量140 g，當發酵至6周時結束發酵；薏米發酵可裝量143 g，當發酵至5周時結束發酵；大米發酵可裝量148 g，當發酵至6周時結束發酵；燕麥發酵可裝量145 g，當發酵至4周時結束發酵。

4 結 論

山西呂梁山南段的樺褐孔菌，作為目前發現的生長在最南地區的種類，與我國東北地區樺褐孔菌相比，其多糖含量極高、鉀元素含量極高，具有很高的開發利用價值。本文首次對山西樺褐孔菌的相關研究進行了報道。現階段我們對山西樺褐孔菌只進行了形態特征、分子生物學鑒定、環境條件分析、品質鑒定和固態發酵初步研究等，下一步還將對山西產樺褐孔菌進行更廣泛深入的研究。