蒸制時間對滇黃精抗氧化活性及吸附膽酸鹽的影響

劉品華，馮亞娟，潘 焦，袁加麗，楊 芬 ，劉明研

(1.曲靖師范學院化學與環境科學學院，云南 曲靖 655011；2.廣西百色農業學校，廣西 百色 533000)

【研究意義】滇黃精(PolygonatumkingianumColl. et Hem-sl)是百合科(Liliaceae)黃精屬(PolygonatumMill.)植物。在1890年由Coll和Hemsl發表的新種，以單獨一個種歸屬于一個滇黃精系，反映出滇黃精在形態特征上與黃精屬的其他植物有較明顯的區別，滇黃精是中藥黃精3個基源品種之一，以塊大、色黃、潤澤、切片透明的品質著稱，主要分布在以云南為中心的西南地區，在貴州、廣西、四川等省區也有分布，適宜生長在海拔2000～3900 m的陰濕林地和灌木叢中[1]。滇黃精蒸制后，色澤變深、糖性變濃、略帶甜味、易吸潮。黃精(Polygonatumsibiricum)是中國傳統中藥之一，營養成分豐富，自古藥食兼用。2012年國家衛計委公布黃精既是食品又是藥品，其治療和保健作用，已被中國兩千多年的臨床實踐所證實。近年黃精在食品等領域的開發應用受到廣泛關注，炮制品通常采用入藥煎煮、沸水沖泡飲用或直接食用。探討蒸制時間對滇黃精功能性的影響，對開發滇黃精功能性產品的加工技術參數有重要的參考意義。【前人研究進展】黃精主要功效為降血糖、降血脂、預防動脈粥樣硬化、補益腎精、滋陰潤肺、增強免疫功能、延緩衰老、改善記憶功能、防止老年癡呆、抗抑郁、抗炎等[2-4]。生品黃精會刺激咽喉，導致口舌麻木，有一定的毒性[5]，炮制得當可去其毒性，消除刺咽麻舌，還可提高黃精的臨床療效，增強補脾益腎、潤肺的效果[6]。滇黃精隨蒸制時間的延長，色澤逐漸加深，還原糖、粗多糖發生變化[7]。更多研究報道顯示炮制后黃精的成分組成都發生了變化。【本研究切入點】蒸制導致滇黃精成分發生變化，而成分決定功效。自由基是帶有未配對電子的原子或分子，能獨立存在，生物體內由于物質代謝過程發生多種生化反應，其中間體代謝產物會不斷的產生自由基[8]。人體內自由基分為活性氧、活性氮自由基兩大類[9-10]，如果自由基引發的機體損傷超過了機體自身的修復能力，就會導致細胞分化發生改變，從而造成機體蛋白質損傷、DNA改變、生物酶失活、脂質過氧化等[11]，引發腫瘤、心腦血管疾病、關節炎、糖尿病等[12]。由腸道中物質吸附機體分泌的膽酸鹽、膽固醇排除體外，減少機體再次吸收，可有效降低體內血脂。【擬解決的關鍵問題】黃精蒸制后成分組成會發生變化，為此針對蒸制時間對滇黃精抗氧化活性、吸附膽酸鹽和膽固醇能力的關系進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

滇黃精：云南煜欣農林生物科技有限公司藥材種植基地提供；1,1二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：阿拉丁生化科技股份有限公司，96 %；三羥甲基胺基甲烷(Tris)：進口分裝，Buffer Grade>99.5 %；膽酸鈉、牛磺膽酸鈉：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，98 %；甘膽酸鈉：成都艾科達化學試劑有限公司AR；脫氧膽酸鈉：上海麥克林升華科技有限公司(美國進口分裝)，98 %；胰酶：Potency 1:4000，上海瑞永生物科技有限公司，BR；膽固醇：上海凱揚生物技術有限公司，AR；考來烯胺散：南京厚生藥業有限公司；其他試劑均為分析純。

TU-1810型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；AL204-IC型電子天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；LD-4臺式離心機：常州天瑞儀器有限公司；XH-C漩渦混合器：上海汗諾儀器有限公司；PS-40超聲波儀：深圳市超藝達科技有限公司；WHY-2往返水浴恒溫振蕩器：江蘇省金壇市大地自動化儀器廠；LC-ZFG002蒸飯柜：廣東樂創電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理 鮮滇黃精洗凈后切片(厚度約2 mm)，曬干得滇黃精干片。干片粉碎，過60目篩，在105 ℃下烘至恒重，得自然干燥檢樣，放于干燥器中備用。

1.2.2 蒸制制樣 取滇黃精干片2.5 kg，加入5 kg水潤透后進行蒸制。蒸制時間至12、24、48、72、96 h時分別取出約1.5 kg，在80 ℃熱風干燥箱中干燥后粉碎，過60目篩，在105 ℃恒溫烘箱中烘至恒重，得蒸制不同時間的檢測樣，放于干燥器中備用。

1.2.3 還原能力試驗 參照文獻[13]，稱取自然干燥檢樣0.5000 g于50 mL容量瓶中，加入約25 mL水，放入沸水浴加熱10 min，取出冷卻后在400 W超聲儀中超聲10 min，取出用純水定容至刻度，轉入50 mL離心管中4500 r/min離心10 min，分離出的清液為水溶性成分試樣測試液。分別移取試樣測試液0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL到15 mL帶蓋離心管中，補充純水至0.25 mL，各離心管中分別加入pH=6.6， 0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液2.50 mL及濃度為1 %的鐵氰化鉀溶液2.50 mL，旋渦儀上混合均勻，放入50 ℃恒溫水浴中30 min取出，再放入冰水浴中快速冷卻，然后加入5 %的三氯乙酸溶液5.00 mL，旋渦儀混合均勻，再加0.1 %的三氯化鐵溶液0.50 mL，混合均勻后(相當于試樣濃度為0.0000、0.0465、0.0930、0.1395、0.1860、0.2326 mg/mL)于室溫下靜置10 min。同時采用不加1 %鐵氰化鉀溶液的為對應空白樣，平行同法操作。用1 cm比色皿，在700 nm測定吸光度。同法檢測蒸制12、24、48、72、96 h的滇黃精樣品檢測樣。

1.2.4 清除DPPH自由基試驗 參照文獻[13]，用無水乙醇配制濃度為0.20 mmol/L的DPPH溶液，在0～4 ℃下避光保存(4 h內使用)。稱取自然干燥檢樣0.5000 g于50 mL容量瓶中，同1.2.3中方法操作，制得試樣測試液。分別取試樣測試液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL到15 mL的帶蓋的塑料離心管中，補加純水至總體積為2.00 mL，各離心管中分別加入0.20 mmol/L的DPPH溶液2.00 mL(此時相當于試樣濃度為0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/mL)，旋渦儀上混合均勻，置于暗處室溫放置反應30 min。用1 cm石英比色皿，517 nm測吸光度為A1，用2.00 mL水代替樣液同法測得吸光度為A2，用2.00 mL純水代替DPPH溶液同法測得吸光值為A3，用純水作為空白。同法檢測蒸制12、24、48、72、96 h的滇黃精檢測樣。試樣對DPPH自由基的清除率計算公式。

1.2.5 清除羥基自由基(·OH)試驗 參照文獻[13]，稱取自然干燥檢樣0.7500 g于50 mL容量瓶中，同1.2.3中方法操作，制得試樣測試液。在25 mL的容量瓶中依次移取2 mmol/L硫酸亞鐵溶液2.00 mL、6 mmol/L雙氧水溶液2.00 mL，旋渦儀上混合均勻，補加6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液至刻度，在36～37 ℃的恒溫水中反應25 min。以純水為空白。用1 cm比色皿，510 nm測定吸光度A0值。

取5個25 mL的容量瓶，每個容量瓶中依次移取2 mmol/L硫酸亞鐵溶液2.00 mL和6 mmol/L雙氧水溶液2.00 mL，再分別于容量瓶中加入0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL試樣測試液，混合均勻后用6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液定容至刻度(相當于試樣濃度為0.12、0.24、0.36、0.48、0.60 mg/mL)，在36～37 ℃的恒溫水浴中反應25 min。以純水為空白。用1 cm比色皿，在510 nm測定吸光度Ax值。用純水2.00 mL代替6 mmol/L雙氧水溶液2.00 mL，同法操作，測定吸光度Ax0值。同法檢測蒸制12、24、48、72、96 h的滇黃精檢測樣。羥基自由基清除率計算公式。

1.2.7 吸附膽酸鹽能力試驗 參照文獻[14～15]，于1個100 mL組培瓶中，分別精密稱取自然干燥的滇黃精0.1000 g，加水至10.0 g。模擬人體胃環境，加入人工胃液10.0 g(人工胃液：濃鹽酸∶水=234∶1000 v/v的稀溶液16.4 mL，加水稀釋成1 000 mL，加入胃蛋白酶10 g，混勻即得)，放入搖床恒溫37 ℃，60 min后取出。繼續模擬腸道環境，用0.5 %的氫氧化鈉溶液調pH為6.8，再補加pH=6.8的磷酸緩沖溶液至25.0 g，加入人工腸液10.0 mL(取磷酸二氫鉀3.4 g，加水250 mL使溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至6.8，加水稀釋至500 mL，加入胰酶5 g，混勻即得)，加入0.5 mmol/L的膽酸鹽20.0 mL(樣品組)，放入搖床37 ℃水浴1 h后取出，加水補充至55.00 g。濾紙過濾(拋棄前過濾液約10 mL)，吸取過濾清液2.0 mL到15 mL的帶蓋離心管中，于離心管中加入60 %的硫酸10.0 mL，放入70 ℃恒溫水浴20 min，取出放入冰水浴中3 min。同時平行試驗3份。用蒸餾水作為空白，用1 cm比色皿于387 nm測其吸光度，樣品試驗組3份吸光度的平均值記Ad1。

用pH 6.8的磷酸緩沖溶液20.0 mL代替0.5 mmol/L的膽酸鹽20.0 mL(對照組)，同法平行試驗。對照組3份的吸光度平均值記Ad2。

樣品組剩余膽酸鹽吸光度Ad計算公式：Ad=Ad1-Ad2。

不加滇黃精樣品同法試驗，加入0.5 mmol/L的膽酸鹽20.0 mL的3份吸光度平均值記為Ad01，用pH 6.8的磷酸緩沖溶液20.0 mL代替0.5 mmol/L的膽酸鹽20.0 mL的3份吸光度的平均值記為Ad02，空白組膽酸鹽吸光度Ad0計算公式：Ad0=Ad01-Ad02。

采用相同質量的檢測樣及考來烯胺，同法試驗、計算，比較其相對吸附能力。對膽酸鹽吸附率計算公式(上述試驗計量及方法)：

同法檢測蒸制12、24、48、72、96 h的滇黃精檢測樣和考來烯胺。試驗四種膽酸鹽分別為膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、甘膽酸鈉。

1.2.8 膽固醇吸附率的檢測 參照文獻[14～15]，膽固醇標準曲線參照GB/T 5009.128作適當修改。吸取用冰醋酸配制的100 μg/mL膽固醇標準工作液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL分別置于6個10 mL刻度具塞試管中，各管中補充冰醋酸，使總體積皆達4.0 mL。沿試管壁加入鐵礬顯色液2.0 mL(取磷酸配制的41.80 mg/mL硫酸鐵銨溶液10 mL，用硫酸定容至100 mL)，旋渦儀上混勻，室溫放置15 min，564 nm測定吸光度(掃描顯示564 nm為最大吸收峰)。吸光度值(A)為縱坐標，膽固醇濃度(μg/mL)為橫坐標，做標準曲線，得回歸方程：Y=0.0224x-0.0075，R2=0.9982。

精密稱取0.5 g自然干燥檢樣，置于50 mL容量中，加入人工胃液10.0 mL，放入37 ℃的搖床水浴1 h取出。用濃度為0.5 %的氫氧化鈉溶液調整pH =6.8后，加入人工腸液10.0 mL，加入2 mg/mL的膽固醇無水乙醇溶液5.0 mL混勻，放入37 ℃的搖床，水浴1 h取出，補充水至刻度，混勻。過濾(丟棄初濾液約5～10 mL)，取過濾清液4.0 mL于15 mL帶蓋離心管中，加入氯化鈉0.8 g搖動溶解，加入石油醚(沸點60～90 ℃)9.0 mL，于漩渦儀上振蕩2 min，然后靜止1 h。取上層石油醚2.0 mL到10 mL具塞試管中，放入65 ℃水浴中用氮氣吹干，加入冰醋酸4.0 mL，鐵礬顯色液2.0 mL，混勻，靜止15 min。用無水乙醇5.0 mL代替膽固醇溶液平行試驗作為空白。在564 nm波長下測吸光度值，由回歸方程計算剩余膽固醇質量。同法檢測蒸制12、24、48、72、96 h的滇黃精檢測樣及考來烯胺。

膽固醇吸附率(mg/g)=

1.2.9 數據處理 采用Excel進行組間單因素方差分析，用自然干燥組比對蒸制不同時間組間變化的差異性，P>0.05表示與自然干燥組間無差異性，P<0.05表示與自然干燥組間差異顯著，P<0.01表示與自然干燥組間差異極顯著。

以樣品的濃度對吸光度或自由基清除率(或抑制率)作圖并進行線性回歸分析，計算IC50。IC50定義為吸光度為0.5或自由基清除率(或抑制率)為50 %時樣品的濃度(mg/mL)。

試驗精密度為重復性條件下兩次獨立檢測結果的絕對差值小于算術平均值的10 %，試驗結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 還原能力試驗結果

還原能力是反映物質給出電子能力的大小，給出電子的能力越大，其還原性就越強，抗氧化活性也就越高。

由圖1可知，蒸制時間越長還原能力越好。與自然干燥組比較，蒸制12 h還原能力變化不顯著，蒸制24 h后變化顯著。從P值的差距可看出蒸制48、72、96 h的變化不大，蒸制時間建議控制在48 h。由參考文獻[7]可知蒸制48 h時還原糖含量最大，但還原能力并不是最大，原因是還原糖的檢測是把Cu2+還原為Cu+，而還原能力是把Fe3+還原為Fe2+。

圖1 蒸制不同時間還原能力檢測結果Fig.1 The reducibility of different steaming time

Fe3++e-Fe2+標準電極電勢E°=0.771

Cu2++e-Cu+標準電極電勢E°=0.153

標準電極電勢說明Fe3+比Cu2+有更高的獲得電子能力。蒸制72 h還原糖含量下降[7]，但還原能力并沒有下降。說明隨著蒸制時間的延長，電極電勢大于0.153小于0.771的能溶于水的非還原糖成分在逐漸增多。IC50隨著蒸制時間的延長而下降，文獻[16]報道的黃精除去正丁醇、乙酸乙酯、石油醚可溶成分后的水提取物的IC=50總還原能力為0.078 mg/mL，約與蒸制48 h的滇黃精相當。

2.2 清除DPPH自由基試驗結果

1958年提出DPPH檢測方法，DPPH是由3個苯環的共振穩定及空間障礙作用，形成以氮原子為中心的穩定自由基，由于自由基清除劑可以與其單電子配對而使吸光度逐漸減小，減小程度與配對的電子數量成定量關系，從而可在517 nm處檢測吸光度的變化，進行快速的定量分析，用于抗氧化成分的體外抗氧化性評價[17]。

由圖2可知，清除DPPH自由基能力與自然干燥的比較，蒸制12 h的差異性不顯著(P=0.156)，蒸制24 h差異顯著(P=0.030)，蒸制48 h后差異非常顯著(P=0.007、0.004、0.004)。隨著蒸制時間延長清除DPPH自由基的能力也逐漸增加，由此說明，蒸制會生成清除DPPH自由基的成分，蒸制48 h后的差異不大，最大清除率約為93 %。高于陳毅堅報道的滇黃精黃酮清除DPPH自由基的最大清除率91.29 %[18]。試驗表明IC50隨著蒸制時間的延長而降低。文獻[16]報道的除去黃精中正丁醇、乙酸乙酯、石油醚可溶成分后的水提取物的DPPH自由基清除率IC50為0.092 mg/mL，遠遠小于本研究的檢測結果，原因可能是原料品種或者是檢測成分處理方法不同所致(部分溶于正丁醇成分也可能在水中也溶解)。另有文獻[19]報道黃精正丁醇提取物對DPPH自由基的清除率高于乙酸乙酯提取的成分，石油醚提取物未表現出DPPH自由基清除能力。說明黃精中起到清除DPPH自由基作用的成分與極性成正相關性。從清除DPPH自由基差異性分析，蒸制48 h較為適合。

圖2 蒸制不同時間清除DPPH自由基能力檢測結果Fig.2 The DPPH radical scavenging efficiency of different steaming time

2.3 清除羥基自由基(·OH)試驗結果

目前所知·OH性質活潑、具有強氧化能力，是對生物體毒性最強、危害最大的自由基。·OH可以通過電子轉移、加成、脫氫等方式與生物體內的多種分子作用，造成蛋白質、核酸和脂類等物質的氧化性損傷，導致細胞壞死或突變，且與機體衰老、腫瘤等有關[20]。

由圖3中P值比對可知，自然干燥與蒸制12、24 h的清除羥基自由基差異性不顯著(P=0.369、0.085)，與蒸制48、72、96 h的差異非常顯著(P=0.007、0.004、0.002)。隨著蒸制時間的延長IC50逐漸下降。蒸制48 h組，與蒸制72、96 h的組間p值分別為0.738、0.494，說明蒸制48、72、96 h的組間差異不顯著，蒸制48 h較為適合。

圖3 蒸制不同時間清除·OH能力檢測結果Fig.3 The scavenging efficiency of hydroxyl radical (·OH) under different steaming time

圖4 蒸制不同時間抑制效果檢測結果Fig.4 The inhibition efficiency of superoxide anion radical under different steaming time

有文獻報道用電化學法檢測酒制黃精、蜜炙黃精水溶解成分對清除·OH的IC50分別為0.111、0.132 mg/mL[21]，好于試驗蒸制的滇黃精。脫色、脫蛋白質后黃精多糖濃度為 4.0 mg/mL時，對羥基自由基(·OH)清除率最大達到 58 %[22]。IC50大于本研究的試驗結果，說明蒸制后產生溶于水的成分清除羥基自由基(·OH)效果優于黃精多糖。

2.4 抑制超氧自由基試驗結果

2.5 吸附膽酸鹽試驗結果

設定相同質量，模擬胃腸道環境，以考來烯胺作參照，試驗蒸制不同時間滇黃精結合膽酸鹽的效果見圖5。

圖5 蒸制不同時間吸附膽酸鹽試驗結果Fig.5 The adsorption efficiency of sodium cholrate under different steaming time

表1 蒸制不同時間吸附膽固醇試驗結果Table 1 The adsorption efficiency of cholesterol under different steaming time

由圖5可知，滇黃精隨著蒸制時間的增加對膽酸鹽的吸附能力呈現遞增的趨勢。自然干燥樣品與蒸制12 h樣品吸附4種膽酸鹽效果的組間差異顯著(P=0.035)，與蒸制24 h后的樣品及考來烯胺的差異都非常顯著(P=0.003、2.4E-05、1.9 E-05、1.6 E-05、2.5 E-06)。從P值可知蒸制48、72、96 h之間的差異較小(P=2.4E-05、1.9 E-05、1.6 E-05)，所以蒸制到48 h較適合。考來烯胺與蒸制12、24、48、72 h的組間P值分別為4.1E-05、0.003、0.005、0.009，差異性非常顯著，但與蒸制96 h的組間P=0.077，差異性不顯著，說明蒸制到96 h的滇黃精與考來烯胺吸附膽酸鹽的作用基本相當。實踐中黃精入藥都需炮制(如：九蒸九曬)，炮制過程隨蒸制時間的延長黃精多糖含量隨之下降[7]。目前未見使用多糖含量高的生黃精入藥效果好于炮制品的報道。據此蒸制雖然減少了多糖含量但提高了對膽酸鹽的吸附，所以降血脂的功效并沒有降低。

2.6 吸附膽固醇試驗結果

黃精能明顯抑制羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)的活力，減少內源性膽固醇的生成，有預防動脈粥樣硬化(AS)和肝脂肪浸潤作用[23]。膽固醇在人的腸道中有一定量的存在，考查滇黃精蒸制不同時間在腸道中吸附膽固醇的能力可判斷膽固醇被腸道吸收再進入人體內循環的情況。

由表1的P值可知，自然干燥與蒸制48 h的吸附膽固醇效果差異顯著(P=0.031)，吸附率下降1.15 mg/g，蒸制其它時間段的則差異不顯著(P=0.923、0.385、0.612、0.634)，說明蒸制時間對吸附膽固醇影響較小。

3 討 論

生物體內存在多種活性氧自由基，運動會引起體內自由基增加[3]。羥基自由基對生物機體有較強破壞力且很活躍[24]。活性氧自由基還與自身免疫疾病的發生發展密切相關[25]。抗氧化物質就是通過阻止自由基的啟動和傳遞鏈反應，從而預防或減輕自由基對生物機體造成的損傷，達到疾病防治的目的[26]。

黃精含有大量的糖類成分，在炮制過程中產生的還原糖類與氨基化合物反應(美拉德Maillard)，生成多種產物，最終產物為類黑精[27]。近年研究表明類黑精具有抗氧化性、抗自由基的作用[28-29]，有助于減少人體氧化損傷，預防相關疾病。黃精通過炮制后得到的類黑精類成分具有較好的抗氧化活性，增強了益腎、健脾的生理作用[30]。滇黃精可溶性成分含量約為80 %，隨蒸制時間的不同有一定的變化，蒸制時間越長生成的5-羥甲基糠醛等類黑精成分越多[7]。對蒸制不同時間滇黃精，取相同質量用水定容，檢測比較水溶性成分的抗氧化活性，蒸制時間越長抗氧化活性也就越強。與楊華杰等[31]采用4中方法炮制黃精，炮制品提取液具有顯著抗氧化作用的結論一致。

人進食后肝膽會分泌膽酸鹽及少量膽固醇進入腸道，其中部分膽酸鹽、膽固醇會與腸道內食品中的成分結合被排除體外，部分再次被腸道吸收循環。膽酸鹽排出體外會促使肝臟不斷把體內膽固醇轉化成膽酸鹽，促進膽固醇降解代謝，從而起到降血脂的作用[13-14]。考來烯胺是治療高血脂癥、高膽固醇癥的藥品，主要作用就是從腸道中結合膽酸鹽、膽固醇排除體外達到治療目的，試驗以考來烯胺作比對可直觀的看出降脂的效果。

4 結 論

滇黃精抗氧化活性和吸附膽酸鹽的能力隨蒸制時間的延長而增加，蒸制時間變化基本不改變吸附膽固醇的能力。試驗結果表明，滇黃精蒸制48 h較為適合，對指導開發加工滇黃精功能性食品有著重要的參考價值。