海島棉GbGPAT2基因的克隆與表達分析

甄軍波，劉琳琳，杜海英，劉 迪，蔡 肖，張建宏，遲吉娜

(河北省農林科學院棉花研究所/農業部黃淮海半干旱區棉花生物學與遺傳育種重點實驗室，河北 石家莊 050051)

【研究意義】棉花是世界上重要的經濟作物，棉籽油也是大豆、油菜、向日葵和花生之外重要的油料來源之一[1]，利用棉籽油開發生物柴油，既能提高棉籽的綜合利用率，又能實現能源的可再生，降低對化石能源的依賴，從而保護生態環境。甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)是植物三酰甘油類合成過程中的限速酶，相比于其他作物，棉花GPAT基因的研究相對較少，發掘棉花GPAT基因，對于深入解析棉籽油合成機理、提供棉籽含油量具有十分重要的意義[2-5]。【前人研究進展】甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)是植物生物膜中磷脂酰甘油(PG)生物合成過程中的第一個酰基酯化酶，是Kennedy途徑的第一步，被認為是TAG生物合成的“閥門”，其對底物的選擇性對決定PG分子中的不飽和程度起著關鍵性作用，與種子油份關系密切[6]。張楠[7]和朱雙[8]等分別從小桐子中克隆了GPAT基因，分別命名為JcGPAT和JcGPAT2。擬南芥中鑒定了10個GPAT基因，包含AtGPAT1-9和AtATS1。AtATS1定位于質體，AtGPAT1-3定位于線粒體膜，AtGPAT4-9則定位于內質網膜[2]。AtGPAT1在擬南芥花粉管發育中發揮重要作用[9]。Men等[10]研究表明，OsGPAT3與水稻的花粉管發育和育性有關，并推測GPAT3基因在單子葉和雙子葉植物中發揮的作用不盡相同。Sui等[11]將堿蓬的SsGPAT基因轉化擬南芥，提高了轉基因擬南芥的耐鹽性，通過增加擬南芥不飽和脂肪酸含量，從而降低了高鹽脅迫對于光合系統的影響。看見，GPAT家族基因在植物生長發育中發揮著重要的作用，有必要進一步深入研究。【本研究切入點】本研究從海島棉中同源克隆獲得一個新的GPAT基因，命名為GbGPAT2(登陸號為：KC292646)，對該基因進行了生物信息學分析，通過實時定量PCR檢測了該基因在幼胚發育不同時期的表達特異性，并在煙草中對其亞細胞定位進行了驗證。【擬解決的關鍵問題】為進一步研究GbGPAT2在棉花中的功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 用于目的基因克隆的海資8號(海島棉)為河北省農林科學院棉花研究所分子設計育種研究室提供，種植于河北省農林科學院棉花研究所試驗地。種子置于黑暗培養箱中，經12 ℃處理8 h，恢復25 ℃正常條件培養，取正在萌發的種子，立即放于液氮中，備用；分別取開花后16、25、30、35 d 的胚，液氮速凍，用于檢測GbGPAT2的表達量。

1.1.2 質粒、菌種與試劑 克隆載體pT-Easy Vector、Premix ExTaq、DNA標準分子量DL2000、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒、反轉錄試劑盒均購自TransGen公司；植物總RNA提取試劑盒購自北京奧萊博生物有限公司；其他常規試劑均為國產分析純。

1.2 總mRNA 提取和反轉錄

采用北京奧萊博生物有限公司Plant RNA Kit 提取棉花種子和未成熟胚的總RNA，具體方法參照試劑盒說明書。采用TransGen反轉錄試劑盒，進行反轉錄。

1.3 GbGPAT2基因的克隆

以蓖麻ACB30456.1氨基酸序列提交NCBI，獲得棉花EST，通過DNAMAN 軟件拼接序列，獲得電子克隆片段。利用Primer5設計引物擴增基因全長，引物序列為：GPAT-S: ATGAACAGTAGTGAAGGGAAGTTGAAATCA，GPAT-A: TCATTTTTCTTCCAGTTCCAGTCCCCG，引物由Invitrogen公司合成。以cDNA為模板進行PCR，PCR 程序為94 ℃預變性4 min， 94 ℃ 1 min， 55 ℃ 1 min， 72 ℃ 1 min 30 s, 共30 個循環，72 ℃ 10 min，4 ℃ 保溫。將PCR產物在含Goldview的1.0 %瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，電泳緩沖液為1×TAE，電泳30 min后，置于Biored凝膠成像系統觀察照相。用DNA分子量Marker DL2000判斷擴增產物的分子量大小。以瓊脂糖凝膠分離純化試劑盒回收PCR擴增產物，克隆到pT-EASY載體上，然后轉化感受態大腸桿菌TransT3。經菌落培養和藍白斑篩選隨機挑取8個克隆進行PCR 陽性驗證，將獲得的3個陽性單克隆送Invitrogen公司測序。單克隆序列通過NCBI比對，確定克隆序列為目的基因，提交NCBI的ORF finder預測其開放閱讀框，并經BLASTX同源比對驗證。

1.4 序列的生物信息學分析

用NCBI (http://ncbi.nlm.ncih.gov/)中的BLAST、ORF及ExPASY (http://expasy.org/tools/)中的ComputepI/Mw tool 等軟件進行生物信息學分析；通過NCBI CDD數據庫(Conserved Domain Databases), 進行保守結構域的分析；采用ProtParam (http://expasy.org/tools /protparam.html) 進行氨基酸基本理化性質分析；利用Predictprotein (http://www.predictprotein. org/)和SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分別預測跨膜區、功能位點和信號肽；蛋白質的疏水性由ProtScale tool (http://expasy.org/tools/pscale/Hphob.Woods.html)預測。以GbGPAT2作為查詢母序列，在NCBI的GenBank數據庫中搜索與該基因同源的其他物種的氨基酸序列，通過ClustalX軟件進行氨基酸序列比對，采用MEGA4軟件構建系統進化樹。

1.5 qRT-PCR檢測胚發育過程中的表達特異性分析

選取基因特異性較高的序列，設計qRT-PCR引物，qG1：GTGTTTTAAGTCGAATCCCCCG；qG2：CCCTCTCCATCTTTTTCCGCAA。選取開花后16、25、30、35 d的胚，提取RNA，反轉錄獲得cDNA，在德國耶拿熒光定量PCR儀中檢測該基因的表達模式，以組成型表達的泛素基因Ubiquitin7作為內參，PCR程序為: 95 ℃ 2 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 30 s, 40個循環，實驗重復3次。

表1 GbGPAT2氨基酸組成分析Table 1 Composition of the amino acids in GbGPAT2

1.6 GbGPAT2基因的亞細胞定位

設計引物GbGPAT2-F和GbGPAT2-R，將GhbHLH開放閱讀框連接至亞細胞定位載體pCAMBIA1302，挑取單克隆測序驗證后轉化農桿菌GV3101，空載體pCAMBIA1302作為對照，農桿菌菌液注射煙草葉肉細胞，黑暗過夜培養后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察亞細胞定位結果。

2 結果與分析

2.1 棉花GbGPAT2 全長序列克隆

根據特異引物在cDNA中的擴增，獲得約1300 bp左右片段(圖1)，經克隆后測序，發現GbGPAT2基因序列全長為1294 bp，包含 1 個1113 bp 的開放閱讀框，編碼370 個氨基酸的多肽，預測分子量為42.4 kD，等電點為8.72，5′端非翻譯區長40 bp，3′端非翻譯區長141 bp。氨基酸組成成分中，極性氨基酸占24.05 %，疏水性氨基酸占37.57 %(表1)，在GenBank中登錄號為KC292646。

2.2 GbGPAT2的功能結構域分析

用NCBI的Conserved Domains程序預測蛋白的保守區，發現本研究克隆的基因編碼的蛋白是溶血磷脂酰基轉移酶 (LPLAT-LPCAT1-like) 超家族成員(圖2)，該基因編碼的蛋白具有一個典型的溶血磷脂酰基轉移酶相似家族保守區(LPLAT-LPCAT1-like)和酰基轉移酶超家族保守結構域(NAT-SF superfamily)。

M: D2000; 1: GbGPAT2圖1 海島棉GbGPAT2同源基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of GbGPAT2 homology in Gossypium barbadense

2.3 GbGPAT2與其他植物GPAT氨基酸序列多重比對

用BLASTX同源分析顯示，海島棉GbGPAT2氨基酸序列與其他植物GPAT具有較高的同源性(圖3)。GbGPAT2與小桐子、擬南芥GPAT氨基酸序列同源性在87 %～92 %，而與已公開的陸地棉GhGPAT氨基酸序列同源性只有8 %。GbGPAT2編碼的氨基酸有4個序列保守區域，其中motif-1的組氨酸(H)和天冬氨酸(D)殘基、motif-3的甘氨酸(G)殘基、motif-4的脯氨酸(P)殘基都高度保守，被認為是酰基轉移酶家族中重要的催化位點[12]。motif-2的苯丙氨酸(F)和精氨酸(R)以及motif-3中的絲氨酸(S)，在甘油-3-磷酸酰基轉移酶的底物結合中起重要作用[13]。

2.4 GbGPAT2編碼蛋白的跨膜區分析

通過在線的親/疏水性分析(http://cn.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)，發現GbGPAT2的N端肽鏈存在一定范圍的疏水區(圖5，0以上的區段為疏水區)，而其他部分則存在較大范圍的親水區，有較強的親水性(圖4A)。進而通過在線的TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對編碼蛋白跨膜區進行了預測，發現GbGPAT2具有2個顯著的跨膜區，分別在第92～144氨基酸處和第127～144氨基酸處(圖4B)。

圖2 GbGPAT2 氨基酸序列保守結構域Fig.2 Conserved domain of GbGPAT2

黑線標示區域依次為GPAT保守域1-4 圖3 不同植物GPAT蛋白保守區的多序列分析Fig.3 Alignment of deduced amino acid of GPATs from different plants

2.5 GbGPAT2二級結構預測

利用DNAStar軟件分析發現GbGPAT2編碼的肽鏈含36.4 %的α-螺旋，38.3 %的β-折疊，15.1 %的轉角構象，10.5 %的無規則卷曲(圖5)。

圖4 GbGPAT2疏水性和跨膜區預測Fig.4 Prediction of hydrophobicity and trans-membrane region of the GbGPAT2 amino acid sequence

圖5 GbGPAT2氨基酸序列DNASTAR-Protein分析結果Fig.5 Result of GbGPAT2 amino acid sequence analyzed by DNAStar-Protein programe

圖6 GbGPAT2與其他物種GPATs氨基酸系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree analysis of GPATs amino acids

2.6 GbGPAT2同其他物種的進化關系分析

構建陸地棉、擬南芥和小桐子等植物的GPAT氨基酸系統進化樹，發現GbGPAT2在分化時間上較晚，能與小桐子的JcGPAT和擬南芥的AtGPAT9親緣關系較近，而與陸地棉已有的GPAT進化關系較遠(圖6)。

2.7 GbGPAT2在幼胚中的表達模式

在種子形成的胚發育的不同階段，選取16 DPA、25 DPA、30 DPA、35 DPA胚，提取RNA，利用GbGPAT23′-UTR區特異引物，以組成型表達的泛素基因Ubiquitin7作為內參基因，通過qRT-PCR檢測了其表達特異性(圖7)。結果表明，GbGPAT2在胚發育的不同時期表達豐度不同，在開花后25 d 的胚中表達量最大，隨著胚發育的逐漸成熟，GbGPAT2表達量逐漸下降。

2.8 GbGPAT2亞細胞定位

為了驗證GbGPAT2的亞細胞定位信息，本研究構建了pCAMBIA1302-GbGPAT2-GFP融合表達載體，利用農桿菌將空載體和融合載體轉化煙草葉肉細胞，暗培養后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光表達情況，結果表明，GbGPAT2定位于細胞質膜中(圖8)，與預測結果一致。

3 討 論

研究表明，在植物細胞中GPAT主要存在于質體、內質網和線粒體等部位，其中定位于質體中的GPAT是可溶性蛋白，以acyl-ACP為底物進行催化反應，而定位于線粒體和內質網膜上的則是結合蛋白，以acyl-CoA和acyl-ACP為底物[14]。本研究中從海島棉中克隆了GbGPAT2基因，該基因開放閱讀框全長1113 bp，在棉花胚發育25 d表達量最高，在煙草中的亞細胞定位表明，該基因定位于細胞質膜之中。

由于GPAT在sn-1和sn-2進行催化反應的偏好性不同，即使屬于同一亞組，GPAT也可能發揮不完全相同的作用[10,15]。在擬南芥中已經發現了10個AtGPAT基因(AtGPAT1-9和ATS)，其中AtGPAT8和AtGPAT9同源，定位于內質網膜上，有著相似的功能，在Kennedy途徑中控制TAG的生物合成[2]。

橫坐標為胚不同的發育時期(16DPA、25DPA、30DPA、35DPA)，縱坐標為相對表達量圖7 GbGPAT2在胚發育不同時期的表達特異性分析Fig.7 Real-time PCR of GbGPAT2 in different times of embryo development

圖8 GbGPAT2亞細胞定位Fig.8 Subcellular localization of GbGPAT2

GPAT在植物脂類代謝中功能多樣，不但參與TAG的合成，而且涉及膜脂的生物合成和植物的抗性[12-14]。國內外研究者已經從已先后從小桐子[7-8]、擬南芥[9]、番茄[13]、甜辣椒[16]、豌豆[17]等多種植物中克隆到了GPAT基因。將擬南芥和菠菜的GPAT基因分別轉入水稻中，使水稻葉片中磷酸甘油的順式不飽和脂肪酸含量得到了顯著提高[18]。在擬南芥中過表達GPAT基因能夠顯著提高種子含油量[14,19]，擬南芥AtGPAT5在種皮和根中優勢表達，對于擬南芥軟木脂等聚酯類物質的合成以及脂類聚合物的結構都具有重要作用[20]。構建的氨基酸序列系統進化樹表明，GbGPAT2與擬南芥AtGPAT9和小桐子JcGPAT(HQ395225)基因的親緣關系較近，同樣具有高度保守的motif 1-4，以及對應的氨基酸殘基，推測GbGPAT2基因可能與擬南芥AtGPAT8、AtGPAT9和小桐子的JcGPAT具有類似的功能。本研究克隆的GbGPAT2可能參與脂類代謝，在提高種子油含量方面發揮著重要的作用，具體功能如何有待于進一步的研究。