玉米ZmMYB59基因啟動(dòng)子的克隆及功能分析

葉浩田 鄭美霞 孫彩霞 趙光武

(浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院/浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安 311300)

MYB 轉(zhuǎn)錄因子參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝產(chǎn)物的合成及逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)[1-4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，MYB家族基因在玉米種子頂土萌發(fā)過程中受深播和GA大量誘導(dǎo)，是表達(dá)基因數(shù)最多的轉(zhuǎn)錄因子家族，其中ZmMYB59基因表達(dá)下調(diào)倍數(shù)最高[5]。因此，預(yù)測(cè)該基因可能抑制玉米種子頂土萌發(fā)的能力。

啟動(dòng)子是基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控中心[6]，不僅擁有CAAT-box、TATA-box等基本作用原件，還存在某些響應(yīng)逆境脅迫的順式作用元件，所以基因表達(dá)調(diào)控研究的基礎(chǔ)是啟動(dòng)子的功能分析[7]。研究ZmMYB59基因啟動(dòng)子的順式作用元件既可從分子水平探討與種子頂土萌發(fā)性狀相關(guān)基因表達(dá)的機(jī)制，又可通過構(gòu)建該啟動(dòng)子和GUS的融合基因，在水稻中研究該啟動(dòng)子在根、莖和葉中的表達(dá)[8]。目前與玉米種子頂土能力相關(guān)的關(guān)鍵基因的研究尚未見報(bào)道，本研究對(duì)玉米ZmMYB59基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行有目的的缺失，應(yīng)用PCR 技術(shù)分別克隆ZmMYB59基因啟動(dòng)子的不同片段，分別連接GUS報(bào)告基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到水稻中，檢測(cè)水稻根、莖和葉中的GUS活性來初步確定啟動(dòng)子的功能區(qū)域[9]，旨在闡明ZmMYB59基因啟動(dòng)子的功能及其作用方式，以期為玉米遺傳改良提供新的策略和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

ZmMYB59基因啟動(dòng)子克隆所使用的植物材料為玉米自交系‘B73’，種子由本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)繁后，-4 ℃保存?zhèn)溆茫z傳轉(zhuǎn)化使用水稻材料是‘日本晴’。

pMD18-T克隆載體、ExTaq、T4連接酶、dNTP混合物、DL10 000TM DNA marker均購自Takara公司，DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、100%的乙醇、氯仿和異丙醇等其他試劑購自上海生工生物工程股份有限公司，PCR引物合成和DNA序列測(cè)定由上海擎科生物科技有限公司完成[10]。

1.2 ZmMYB59基因啟動(dòng)子的克隆及序列分析

通過CTAB法從玉米自交系‘B73’幼苗組織中提取基因組DNA[11]，利用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(MYB59-P-1-F: ATACATGGTTTGTGATT-CTGAAT；MYB59-P-1-R: GTTACTACCACAC-TAACGTTG；MYB59-P-2-F: CACAATGTGGA-CTGCAGCAC；MYB59-P-2-R: GTTACTACCA-CACTAACGTTG)。

以玉米基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子序列，20 μL PCR反應(yīng)體系為：PCR預(yù)混液10 μL、10 μmol/L 上下游引物各1 μL、基因組DNA 1 μL、ddH2O 7 μL；PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；之后95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)并回收目的片段，目的片段和pMD18-T載體重組并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)檢測(cè)為陽性克隆的菌液送上海擎科生物科技有限公司測(cè)序。使用PlantCARE(http:∥www.plantcare.co.uk/)軟件對(duì)ZmMYB59基因起始密碼子前2 000 bp的序列進(jìn)行分析, 把ZmMYB59基因的2個(gè)啟動(dòng)子片段分別命名為MYB59-P-1，MYB59-P-2。

1.3 pCXGUS-MYB-1K和pCXGUS-MYB-2K植物表達(dá)載體的構(gòu)建

將目的基因與pCXGUS-P載體連接，獲得重組質(zhì)粒分別命名為pCXGUS-MYB-1K, pCXGUS-MYB-2K(圖1)。挑出重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞。參照蘇軍等[12]的方法轉(zhuǎn)化水稻‘日本晴’(圖2)。

1.4 轉(zhuǎn)pCXGUS-MYB-1K和pCXGUS-MYB-2K基因水稻陽性植株的鑒定

獲得轉(zhuǎn)基因苗后進(jìn)行PCR分子鑒定：以轉(zhuǎn)基因水稻葉片DNA為模板，利用啟動(dòng)子pCXGUS-MYB-1K、pCXGUS-MYB-2K上游引物及GUS下游引物5’GTTGCCCGCTTCGAAACCAATG 3’進(jìn)行PCR。反應(yīng)程序是95 ℃ 5 min；之后95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s；72 ℃ (1 kb/90 s、2 kb/150 s)共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min[13]。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物[14]。

圖1 啟動(dòng)子片段pCXGUS-MYB-1K(a)和pCXGUS-MYB-2K(b)的載體構(gòu)建圖

(a)為誘導(dǎo)第7天；(b)為愈傷繼代培養(yǎng)；(c)為農(nóng)桿菌EHA105與目的基因共培養(yǎng)2 d；(d)為篩選第21天；(e)為分化第25天；(f)為28～30 ℃生根培養(yǎng)。

1.5 轉(zhuǎn)基因水稻GUS組織化學(xué)染色

分別取T1代轉(zhuǎn)基因陽性水稻的種子，T1代轉(zhuǎn)基因陽性水稻的萌發(fā)期水稻幼苗和苗期的根、莖和葉，參照J(rèn)efferson等[15]的方法進(jìn)行GUS染色，照相并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmMYB59基因啟動(dòng)子片段的克隆

圖3可知，3、4、5號(hào)樣品獲得1 000 bp的條帶，為啟動(dòng)子MYB59-P-1片段，但1、2號(hào)樣品未擴(kuò)增出啟動(dòng)子片段MYB59-P-1(圖3(a))；6～10號(hào)均擴(kuò)增出2 000 bp片段的條帶，為啟動(dòng)子MYB59-P-2片段(圖3(b))。

分別選擇5號(hào)和10號(hào)擴(kuò)增片段測(cè)序后，采用DNAMAN 6.0軟件(http:∥xiazai.zol.com.cn/detail/38/374365.shtml)進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，5號(hào)和10號(hào)與MYB59-P-1和MYB59-P-2的序列完全一致。

2.2 啟動(dòng)子MYB59-P-1和MYB59-P-2的生物信息學(xué)分析

表1可知，除與啟動(dòng)子MYB59-P-1和MYB59-P-2基本活性相關(guān)的TATA Box和CAAT Box以外，還存在許多與激素響應(yīng)相關(guān)的元件，如響應(yīng)ABA信號(hào)的ABRE元件；響應(yīng)水楊酸信號(hào)的TCA-element元件；響應(yīng)赤霉素的作用元件GARE-motif和P-box元件；與茉莉酸甲酯信號(hào)途徑相關(guān)的TGACG-motif元件；參與抗病和脅迫調(diào)節(jié)的TC-rich repeats元件；與分生組織特異性激活相關(guān)的GCN4-motif元件；參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控的O2-site元件；與分生組織表達(dá)相關(guān)的CAT-box元件；參與熱應(yīng)激反應(yīng)的HSE元件。此外，還發(fā)現(xiàn)1個(gè)受干旱誘導(dǎo)的 MYB 結(jié)合位點(diǎn)的MBS元件。

M，DL10 000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～5，MYB59-P-1片段；6～10，MYB59-P-2片段。

表1 啟動(dòng)子MYB59-P-1和MYB59-P-2中存在的順式作用元件

2.3 轉(zhuǎn)pCXGUS-MYB-1K、pCXGUS-MYB-2K基因水稻的陽性鑒定結(jié)果

圖4可知，轉(zhuǎn)基因水稻幼苗和表達(dá)載體pCXGUS-MYB-1K、pCXGUS-MYB-2K質(zhì)粒均能擴(kuò)增到目標(biāo)條帶MYB59-P-1和MYB59-P-2，而野生型水稻幼苗沒有擴(kuò)增到目標(biāo)條帶。結(jié)果表明，ZmMYB59基因起始密碼子上游1 000和2 000 bp已整合到轉(zhuǎn)基因水稻基因組中。

M1，DL2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)； M2，DL10 000 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，陽性對(duì)照；2，陰性對(duì)照；3～24，轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株。

2.4 pCXGUS-MYB-1K、pCXGUS-MYB-2K轉(zhuǎn)基因水稻萌發(fā)期和苗期GUS染色分析

圖5所示，pCXGUS-MYB-1K轉(zhuǎn)基因水稻的種子未著色，pCXGUS-MYB-2K轉(zhuǎn)化植株的種子胚乳邊緣著色,表明pCXGUS-MYB-1K未驅(qū)動(dòng)GUS在種子中表達(dá)，而pCXGUS-MYB-2K驅(qū)動(dòng)的GUS在種子胚乳邊緣表達(dá)；pCXGUS-MYB-1K的轉(zhuǎn)化植株種子萌發(fā)后僅有芽尖著色，表明其僅驅(qū)動(dòng)GUS在芽尖部位表達(dá)，而pCXGUS-MYB-2K的轉(zhuǎn)化植株的根與芽尖均有著色，根中維管束細(xì)胞著色較少，芽尖著色較深，表明pCXGUS-MYB-2K驅(qū)動(dòng)的GUS主要在芽尖表達(dá)，而在根部維管束組織中表達(dá)較弱。

圖6可知，pCXGUS-MYB-1K，pCXGUS-MYB-2K植株的根、莖、葉均能著色，其中根部?jī)H維管束細(xì)胞著色，后者的根、莖、葉著色均比前者深。推測(cè)ZmMYB59基因的啟動(dòng)子沒有組織特異性，同時(shí)也說明起始密碼子前1 000 bp序列是啟動(dòng)子發(fā)揮正常調(diào)控功能所必須的，且2 000 bp中可能存在增強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)的順式作用元件。

3 討論與結(jié)論

啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄水平重要的調(diào)節(jié)方式備受關(guān)注,通過對(duì)啟動(dòng)子的研究可以預(yù)測(cè)基因啟動(dòng)子中重要的元件，還能由此對(duì)基因的表達(dá)模式進(jìn)行研究。根據(jù)啟動(dòng)子中相關(guān)順式作用元件的分布，將啟動(dòng)子劃分為包含不同長(zhǎng)度的缺失片段，并將缺失片段與帶有GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體融合，通過比較不同缺失片段啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的強(qiáng)弱及其在組織中的定位來鑒定啟動(dòng)子缺失片段的時(shí)空表達(dá)特性與啟動(dòng)子中相關(guān)順式作用元件的作用[16]。

(a)和(e)分別為轉(zhuǎn)pCXGUS-MYB-2K的T1代種子，萌發(fā)期GUS組織化學(xué)染色結(jié)果；(b)～(d)為轉(zhuǎn)pCXGUS-MYB-1K的T1代種子，萌發(fā)期GUS組織化學(xué)染色結(jié)果。(a)，(b)，(e)的比例尺為1 mm；(c)和(d)的比例尺為2 mm。

(a)～(c)依次為‘日本晴’野生型植株的莖、葉和根；(d)～(f)分別為pCXGUS-MYB-1K轉(zhuǎn)化植株的莖、葉、根；(g)～(i)分別為pCXGUS-MYB-2K轉(zhuǎn)化植株的水稻莖、葉、根。

孫永偉等[17]利用啟動(dòng)子缺失的方法發(fā)現(xiàn)響應(yīng)外源激素ABA的應(yīng)答元件在啟動(dòng)子序列660～2 000 bp。大豆rbcS[18]基因啟動(dòng)活性最高的是長(zhǎng)度為712 bp的啟動(dòng)子，長(zhǎng)度為1 089 bp的rbcS基因啟動(dòng)子含有光誘導(dǎo)元件并且還有組織特異表達(dá)特性。PGHNBS[19]啟動(dòng)子的調(diào)控元件中，-1 071～-959 bp 區(qū)域存在韌皮部特異表達(dá)元件，增強(qiáng)子元件位于-1 559～-1 420 bp。

本研究發(fā)現(xiàn)pCXGUS-MYB-1K轉(zhuǎn)化的T1代種子未著色，pCXGUS-MYB-2K轉(zhuǎn)化的種子的胚乳邊緣有著色。通過對(duì)MYB59-P-1和MYB59-P-2的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)可能含有與胚乳表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)控元件GCN4-motif有關(guān)，而調(diào)控模式需要進(jìn)一步探究。葉榮建[20]通過突變體研究發(fā)現(xiàn)順式作用元件(GCN4-like motif)以負(fù)向調(diào)控元件身份來對(duì)EnP3-292胚乳特異表達(dá)模式進(jìn)行調(diào)控。

pCXGUS-MYB-1K轉(zhuǎn)化材料的種子萌發(fā)期只有芽尖著色，pCXGUS-MYB-2K轉(zhuǎn)化材料的芽尖和根均著色，芽尖著色較深，根少量著色，并且GUS在MYB59-P-2的調(diào)控下表達(dá)量較高。苗期pCXGUS-MYB-1K，pCXGUS-MYB-2K植株的根、莖、葉均能染色，推測(cè)ZmMYB59基因的啟動(dòng)子沒有組織特異性，同時(shí)也說明起始密碼子前1 000 bp是啟動(dòng)子發(fā)揮正常調(diào)控功能所必須的；而后者的根、莖、葉染色均比前者深，說明起始密碼子前1 000 bp啟動(dòng)能力不強(qiáng)，推測(cè)前2 000 bp中可能存在增強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)的順式作用元件。

綜上所述，MYB59-P-1在種子中沒有啟動(dòng)功能,在萌發(fā)期和苗期啟動(dòng)功能不強(qiáng),在萌發(fā)期僅芽尖處發(fā)揮功能，而在苗期根、莖和葉中均有調(diào)控功能；表明MYB59-P-1在調(diào)控種子萌發(fā)時(shí)存在時(shí)空差異表達(dá)。啟動(dòng)子的高效表達(dá)需要多個(gè)順式作用元件的協(xié)同及相互作用。通過對(duì)MYB59-P-1和MYB59-P-2的生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)MYB59-P-2中存在大量的脫落酸應(yīng)答元件(ABRE)、與赤霉素響應(yīng)有關(guān)的順式作用元件(GARE-motif)、與分生組織特異性激活相關(guān)的順式調(diào)控元件(CCGTCC-box)、與胚乳表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)控元件(GCN4-motif)、參與熱應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件(HSE)、參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控的順式調(diào)控元件(O2-site)，本研究推測(cè)ZmMYB59基因的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子的調(diào)控不受外界條件的影響，所啟動(dòng)基因的表達(dá)具有持續(xù)性，可顯著地提高外源基因在植物組織中的表達(dá)量，特別是在葉片和莖中，但不具備時(shí)空特異性。明確ZmMYB59基因的啟動(dòng)子類型，有利于后期更好地研究該基因的時(shí)空表達(dá)模式。