基于模糊數學與電阻抗的冰溫貯藏羊肉僵直成熟進程評價

王政綱,趙麗華,王德寶,靳 燁

(內蒙古農業大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特 010018)

冰溫貯藏保鮮技術是一種將生鮮食品放置于0 ℃以下、冰點溫度以上的一種冷藏方式。冰溫貯藏可以讓食品維持在最低的生理活性的水平,且不易產生凍害,以達到長期保鮮的效果[1]。冰溫貯藏羊肉在(-1 ℃)貯藏條件下保質期能達到30 d以上。冰鮮羊肉作為一種新貯藏方式,所有影響肌肉成熟進程的因素,都會影響冰鮮羊肉成熟進程。羊屠宰之后要經歷僵直遲滯期、僵直快速期、僵直最大期、解僵期、成熟期,由于冰溫貯藏周期長、貯藏溫度波動、個體部位差異等因素成熟周期持續0～10 d[2],所以需要準確評價羊肉宰后僵直及成熟進程的指標與方法,目前常用的指標有測定肌肉的pH、剪切力、肌原纖維小片化指數(Myofibrillar fragmentation index,MFI)、保水性等,但指標需要綜合運用,才能對宰后肌肉成熟進程進行正確判斷,況且指標測定操作復雜、耗時長,不能到達對羊肉成熟過程實現在線、準確、實時監測。

在交流電電路中,介質阻礙電流通過的能力稱為電阻抗(electrical impedance spectroscopy,EIS)[3]。電阻抗能夠快速反映肌肉組織內部結構、生理生化特性,且設備使用方便,檢測結果快速,一直是人們研究的熱點,其在肉制品中的應用也在不斷擴展[4]。目前,電阻抗技術已被應用于評估肉中脂肪的含量、測定肉 pH的變化、監測肌肉失水量、異常PSE肉(Pale Soft Exudative)和DFD肉(Dark Firm and Dry)的識別、控制肉的成熟度、凍肉與非凍肉的區別等方面[5-6]。

模糊綜合評判法(Fuzzy Comprehensive Evaluation,FCE),是一種運用模糊數學原理從多個指標對被評價事物隸屬狀況進行綜合性評判,把被評判事物的變化區間做出區分的一種綜合評價方法。因模糊數學可將模糊特性指標加以綜合概況,現已被廣泛應用到食品品質評價、風險評估等方面。如劉美迎等利用模糊數學綜合評價了各鮮食葡萄品種的優劣[7];鉏曉艷等用模糊數學系統評價電子束輻照劑量對鱸魚品質的影響[8];杜樹新等運用模糊數學實現對食品安全狀態的綜合評價[9],但應用模糊綜合評判法對宰后羊肉僵直成熟進程進行綜合評判還未見相關研究報道。該方法不僅考慮冰溫貯藏過程羊肉不同成熟進程各參數指標的信息量大小、相對重要性,還考慮肉樣的個體差異性、模糊性和不確定性,獲得被評價羊肉宰后不同僵直成熟進程的綜合變化,使得判斷結果更加科學、準確和可靠。本文通過對宰后冰溫貯藏期間羊肉的電阻抗特性參數分析,將生物電阻抗特性結合模糊綜合評判法應用于宰后冰溫貯藏羊肉僵直成熟進程的判斷,旨在通過電阻抗參數檢測,及時掌握羊肉成熟進程,為冰鮮羊肉的工業化生產在線監測提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綿羊 購于呼和浩特和林格爾牧場,品種為內蒙古細毛羊,16 只,6～8月齡,采用清真屠宰方式;氯化鉀 天津市永大化學試劑三廠;氯化鎂 北京化學試劑公司;磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀 天津市科盟化工工貿有限公司;EGTA 國藥集團化學試劑有限公司;以上試劑均為分析純。

LG-BCD冰溫冷藏箱 泰州樂金電子冷機有限公司;pH-STAR型胴體直測式pH計 北京奧依克光電儀器有限公司;數控精密恒溫水浴鍋 上海福瑪實驗設備有限公司;電子精密天平 德國Sartorius公司;DZ-400/2S型真空包裝機 山東省諸城市利德機械有限責任公司;PY-1型膨脹壓縮儀 南京電力自動化設備廠;2型四極式生物阻抗測量儀 華中科技大學生命科技學院;5810-R型低溫臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肉樣預處理 綿羊宰后,取左后腿股二頭肌,平均分割為10 塊,大小為5 cm×4 cm×2 cm,每塊40 g左右,16只羊共計分成160份肉樣,用聚乙烯包裝袋(150 mm×200 mm×0.10 mm)進行真空包裝。包裝之后放入-1 ℃冰溫箱中連續貯藏9 d,屠宰當日和之后每隔1 d對肉樣的pH、失水率、肌原纖維小片化指數和電阻抗參數指標分別進行測定。

1.2.2 pH測定 按照GB/T 9695.5-2008《肉與肉制品pH測定》的方法進行測定[11]。將pH計插入羊肉中,記錄其pH,每個樣品重復測定3次,取其算術平均值為測定值。

1.2.3 失水率測定 按照加壓重量法[12]。用膨脹壓縮儀給面積為5 cm2,厚度為1 cm的肉樣施加68 kPa的壓力,測定被壓出的水量與肉重之比即可計算出其失水率,失水率越大,保水性越差,按下面公式算其失水率。

式中:Q為肌肉失水率(%),W1為施壓前肉重(g),W2為施壓后肉重(g)。

1.2.4 肌原纖維小片化指數(MFI)測定 取2 g 肉樣加20 mL 預冷的 MFI 緩沖液(100 mmol/L KCl,11.2 mmol/L K2HPO4,8.8 mmol/L KH2PO4,1 mmol/L EGTA,1 mmol/L MgCl2)進行勻漿并離心(1000×g,15 min,2 ℃),取沉淀再用 20 mL 上述緩沖液混勻后離心(1000×g,15 min,2 ℃),取沉淀,加入 5 mL 上述緩沖液再次混勻,并過濾除去結締組織,再加入 5 mL緩沖液洗離心管,并進行過濾。將過濾后的混合液測定蛋白濃度,然后用 MFI 緩沖液將其濃度稀釋到0.5 mg/mL,在540 nm下測定其吸光度,將結果乘以 200,即為肌原纖維小片化指數[13]。

1.2.5 電阻抗特性測定 電阻抗值測量采用四針式電級法[10],電極間距1 cm,電極長為2 cm,測量時沿肌纖維組織橫向插入電極約1 cm,如圖1所示。通過生物電阻抗測量儀從5～200 kHz取12個頻率點(5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 kHz),頻率由低到高,測定每個樣品的電阻抗幅值和相位角特性,利用迭代式最小二乘算法擬合出肉樣等效電阻抗參數:細胞膜電容、細胞外阻、細胞內阻、介電損耗正切角、極化系數。

圖1 阻抗測定方向示意圖Fig.1 Denomination of electrical impedance tests

1.2.6 模糊數學模型建立

1.2.6.1 評價因素集確定 根據電阻抗參數顯著性情況,建立羊肉宰后不同僵直成熟進程的評判體系,確立評判指標因素集U={u1,u2,u3,u4,…un}。

1.2.6.2 確定評判集 根據電阻抗參數在宰后僵直快速期、僵直最大期、解僵期、成熟期四個僵直成熟進程的變化范圍,建立評價集V={v1,v2,v3,v4},v1為僵直快速期,v2為僵直最大期,v3為解僵期,v4為成熟期。

1.2.6.3 確立隸屬函數 隸屬函數的確定方法有許多種,隸屬函數的確定方法有許多種,本文選用較為普遍使用的降半梯形分布函數,以確定隸屬度。用i表示各個元素i=1,2,3,4,…n,用j表示僵直成熟進程j=1,2,3,4。隸屬度用rij表示,取值范圍為 0～1,進而得到模糊矩陣R,如下:

式(1)

1.2.6.4 確定模糊評判權重集 模糊綜合評判法中賦權的方法有很多種,權重分配方案的合理與否直接影響著最后評判結果的正確率[14],本文采用的是超標倍數賦權和標準賦權法。超標倍數賦權法計算公式為:

式(2)

式中： Wi為第 i 項指標的權重值;Si為第 i 項指標在僵直成熟階段的平均值,Xi為第 i 項指標在某個僵直成熟階段的實測值。

形成模糊向量A=(W1,W2,W3,W4,…Wn)

變異系數賦權法是反映各指標變異程度的一種賦權方法[15],通過計算各指標的變異系數來衡量各指標的差異程度,以此來確定指標的權重,其計算公式為:

式(3)

式中：Vi為第 i 項指標的變異系數。

形成模糊向量A′=(W1,W2,W3,W4, …Wn)

1.2.6.5 模糊綜合評判 利用模糊矩陣R和模糊向量A,根據模糊數學公式B=A·R,進行模糊矩陣的復合運算,得出宰后成熟進程模糊綜合評判結果,B向量中的最大值表示綜合評判的最佳結果。

1.3 數據分析

使用Microsoft Excel 2003進行數據處理,運用SPSS 19.0軟件(IBM公司)對數據進行基于Duncan’s多重比較的方差顯著性分析(P<0.05),對模糊權重系數和模糊判別過程進行分析[15-16]。

2 結果與分析

2.1 羊肉貯藏期間理化品質的變化

圖2 宰后不同時間羊肉理化指標的變化Fig.2 Changes in physicochemical property values of mutton during ageing

如圖2所示,在僵直快熟期,羊肉的pH呈快速下降趨勢,失水率呈不斷上升趨勢,MFI指數呈先上升后下降趨勢,但變化幅度不大。在僵直最大期,羊肉的pH、失水率、MFI指數變化不大。在解僵期,羊肉的pH呈緩慢上升的變化趨勢,失水率呈不斷升高的變化趨勢,MFI指數不斷升高。在成熟期,羊肉的pH、失水率變化不大,MFI指數持續升高。因此,根據宰后羊肉的pH、失水率、MFI指數三項理化指標的綜合應用,可以確定羊肉宰后所處四個僵直成熟進程階段的精準時間范圍。在本研究中,羊肉在冰溫貯藏條件下在宰后的8～48 h為僵直快速期;在宰后的48 h 時達到僵直最大化,并持續到宰后的72 h;從宰后72 h到168 h為解僵成熟過程;宰后168 h 以后羊肉進入后期成熟過程。

2.2 羊肉貯藏期間電阻抗特性的變化

肌肉組織的電阻抗特性主要取決細胞內外電阻率、細胞內外液體量、細胞膜容抗及廣泛分布的電容等,多種因素的影響使電阻抗特性具有其復雜性,使得肌肉組織內部形成了復雜的電學網絡。細胞膜電容Cm是衡量肌肉細胞膜完整性的指標,同一肌肉組織其Cm值越小,說明肌肉的細胞膜破損程度越大[17]。羊肉貯藏過程中細胞膜電容Cm的變化如圖3a所示,在冰溫貯藏過程中,隨貯藏時間的延長肌肉組織的Cm逐漸降低,宰后8和216 h的Cm值分別為41.2、15.32 pF,且細胞膜電容Cm在不同貯藏時間存在顯著性差異(P<0.05),說明肌肉細胞膜作為介電絕緣體,它的絕緣性能隨著細胞膜磷脂雙層的氧化和宰后細胞自身的溶解作用的增強,細胞膜的滲透性增強,而逐漸減小[18]。

圖3 宰后不同時間羊肉電阻抗特性的變化Fig.3 Changes in the electrical impedance values of mutton during ageing

細胞外阻Re是反映肌肉組織細胞外液導電能力大小的指標,細胞外的離子強度越大,細胞外阻Re值越小,細胞總體的阻抗性越弱,導電性越強[19]。冰鮮羊肉貯藏過程中肌細胞外阻Re值變化規律如圖3b所示。肉樣Re值在宰后貯藏的過程中,呈現先上升后降低再趨于穩定的趨勢,貯藏24 h時Re值達到最大。Jean-Louis等在研究宰后牛肉貯藏過程的介電特性時也得到類似結論[17],其原因可能是宰后隨著肌肉僵直、解僵、成熟過程的進行,肌細胞膜不斷降解破裂,細胞內外離子交換程度加強大,細胞內外逐步形成滲透壓差,導致細胞外離子強度增加,導電性逐漸增強,細胞外阻Re逐漸減小[20]。

細胞內阻Ri是衡量肌肉細胞內液體導電能力大小的指標。對于肌肉組織,細胞內的離子強度越大,細胞內阻Ri越小,細胞阻抗越小,導電能力越強。冰鮮羊肉貯藏過程中細胞內阻Ri值變化如圖3c所示,隨著貯藏時間的延長,肉樣的細胞內阻Ri值呈現先增加后減少的趨勢,在貯藏24 h時肉樣的Ri值達到最大值,這可能是由于貯藏時間的延長,肌肉組織內質網和線粒體中的Na+、Cl-和K+等離子從細胞器中被逐步釋放出來,細胞內離子數量強度增加,導電能力上升,細胞內阻抗降低[19]。隨著宰后羊肉成熟過程的進行,肌肉的細胞內阻Ri值趨于穩定。

肌肉組織的介電能力由兩部分組成,即主動部分和被動部分。主動部分ε′是表示肌肉組織的相對透電能力,被動部分ε″表示肌肉組織可吸收的能量,ε″和ε′的比值稱為介電損耗正切角(tanδ),其值大說明肌肉組織吸收電能的能力強于擴散的電能,其值小說明肌肉組織吸收電能的能力弱于擴散的電能[21]。冰溫貯藏過程中肉樣的tanδ值變化如圖3d所示,剛宰后肉樣的tanδ值最大,之后隨著貯藏時間的延長,肉樣的tanδ值呈單調下降的趨勢,這說明羊宰后隨著僵直化的進行,肌肉組織細胞膜不斷降解,肌肉組織的吸收電能力降低,透過電能力增強,從而使肌肉組織的介電損耗正切值呈單調下降的趨勢。

極化系數k是衡量肌肉生命狀態的一個指標,肌肉細胞在死亡過程中其極化能力會發生崩潰,相應地肌肉組織電阻抗離散度和極化系數都會減小。從肌肉細胞開始死亡到結束,極化系數從最大值逐漸降低到單位數值1[22]。 冰溫貯藏過程中肌肉的極化系數k變化規律如圖3e所示,剛宰后肌肉的極化系數k值最大,隨著貯藏時間的延長,肉樣的極化系數k值也呈逐漸下降的趨勢,這可能是由于羊宰后隨著肌肉僵直、成熟的進行,肌肉組織的生命狀態不斷衰竭,使肌肉組織在高頻和低頻狀態下的生物電阻抗值的差距越來越小。

2.3 有效電阻抗參數提取

為了明確宰后僵直成熟進程對羊肉電阻抗參數的影響,本實驗使用方差分析對其進行了統計學分析,羊肉在冰溫貯藏過程四個僵直階段電阻抗參數變化范圍如表1所示。宰后僵直和成熟過程5種電阻抗參數差異顯著(P<0.01),可確立評判指標因素集U={u1,u2,u3,u4,u5}其中u1為細胞膜電容,u2為細胞內阻,u3為細胞外阻,u4為介電損耗正切角,u5為極化系數。

表1 羊肉僵直成熟各階段電阻抗參數變化范圍值Table 1 Variation range of electrical impedance parameter of mutton during rigor process

這樣就可以確立細胞膜電容、細胞內阻、細胞外阻、介電損耗正切角、極化系數5個評判指標因子在僵直快速期、僵直最大期、解僵期、成熟期所對應的隸屬函數。xi表示羊肉僵直成熟過程第i種電阻抗參數的實測值;用Tij表示第i種電阻抗參數在第j個僵直成熟過程的最大值;用rij表示第i種電阻抗參數對第j個僵直成熟過程的隸屬度,則隸屬度的計算公式如下:當j=1時,僵直快速期隸屬函數式為:

式(4)

當j=2,3時,僵直最大期、解僵期隸屬函數式為:

式(5)

當j=4時,成熟期隸屬函數式為:

式(6)

2.4 模糊綜合評判

利用模糊矩陣R和模糊向量A,根據模糊數學公式B=A·R,進行模糊矩陣的復合運算,得出宰后成熟進程模糊綜合評判結果,B向量中的最大值表示綜合評判的最佳結果。以宰后8 h的某肉樣為例:[Cm]=43.1pF,[Ri]=10.6 Ω,[Re]=182 Ω,[tanδ]=1.35,[k]=5.8按式(4)至(6)算得各指標各級隸屬度,得出模糊關系矩陣R。

根據超標倍數賦權法公式(2),得出權重向量A=(0.30,0.11,0.16,0.19,0.24)

按照變異系數賦權法公式(3),得出權重向量A′=(0.18,0.17,0.26,0.17,0.22)

再將A、A′分別與隸屬矩陣R進行模糊矩陣運算,得出羊肉僵直進程各階段模糊評判計算結果B和B′。

B=(0.30,0.11,0.16,0.19,0.24)

B向量中的最大值為0.647,所得模糊評判結果為羊肉宰后僵直成熟進程的僵直快速期,這與實際相符合。同理算得B′=(0.490,0.254,0.149,0.106),B′向量中的最大值為0.490,所得模糊評判結果同為宰后僵直快速期,符合實際情況,但B向量中最大值要明顯大于B′向量中的最大值(0.647>0.490)。表明超標倍數賦權法準確度高于變異系數賦權法。

2.5 模糊模型驗證

為了檢驗兩種不同模糊評判模式的實際檢驗正確性,取宰后0～9 d成熟過程中28個左后腿肉樣對其進行了驗證試驗。驗證樣品胴體重為15～20 kg,采用伊斯蘭清真屠宰方式。驗證結果表明,兩種評判模式都實現了對宰后羊肉僵直成熟進程的準確評判,但超標倍數賦權法所得的模糊綜合評判結果正確率(93%)要高于變異系數賦權法所得結果正確率(86%),驗證結果如表2所示,說明采用超標倍數賦權法所得的模糊綜合評判精準度要優于變異系數賦權法。

表2 兩種不同評判模式的肉樣驗證結果Table 2 Evaluation results of samples with different models

3 討論

動物肌肉組織受個體差異、宰后肌肉僵直、解僵和成熟過程引起的生理生化反應等影響,肉品質與電參數指標之間的相關性通常很不固定,線性相關性也不是很大[23]。所以利用常規的線性回歸模型,很難實現使用電參數建立對肉品質的評估預測模型,必須結合一些特定的數學方法才能達到有效的評價效果。本實驗研究表明,使用模糊綜合評判法對宰后羊肉僵直成熟進程進行評價是一種比較理想的方法,并且能夠建立可靠、穩定的冰溫貯藏羊肉僵直成熟進程預測模型。

但需要指出的是,本試驗所用的樣品為綿羊后腿股二頭肌,測定的電阻抗值為橫向電阻抗。不同部位、不同月齡、不同電阻抗測定方向等因素都會對肌肉的電阻抗值產生影響[17-20]。此外模糊綜合評判法中賦權方法很多,權重分配方案的合理與否直接影響到評價結果的準確性度,本文選用較為普遍使用的降半梯形分布函數以確定隸屬度,使用超標倍數賦權法和變異系數賦權法兩種方法確定模糊評判權重集。經驗證結果表明,兩種評判模式都實現了對宰后羊肉僵直進程的準確評判,但采用超標倍數賦權法所得的模糊綜合評判結果精準度要優于變異系數賦權法所得評判結果。因此,未來研究工作應該加大樣本的采集量,篩選出準確率更高的隸屬函數和模糊賦權法,實現對不同部位冰溫貯藏羊肉僵直成熟進程的在線精準判別。

4 結論

羊肉在冰溫貯藏條件下在宰后的48 h時達到僵直最大化,從宰后72 h到168 h為解僵成熟過程;宰后168 h以后進入后期成熟過程。羊肉在宰后不同僵直成熟過程5種電阻抗參數差異極顯著(P<0.01),提取Cm、Ri、Re、tanδ、k 5個參數指標,利用模糊矩陣R和模糊向量A,建立模糊評價模型公式B=A·R。通過兩種不同權重模糊評價法對宰后冰溫貯藏羊肉的僵直成熟進程進行綜合評價,構建了兩種模糊綜合評價模型,經驗證準確率在0.86以上,超標倍數賦權模型準確度(0.93)高于變異系數賦權模型。電阻抗測量結合模糊評價做為一種快速無損的羊肉僵直成熟進程監測方法,具有很大的工業生產應用潛力。