活血化瘀合劑對膝骨性關節炎模型兔炎癥因子及TLR4/NF-κB通路的影響

余毅　潘波　楊冬梅　祝家樂　趙洪慶　王芊芊　盧敏　余望貽

摘要：目的??觀察活血化瘀合劑對膝骨性關節炎模型兔炎癥因子及TLR4/NF-κB通路的影響，探討其關節保護作用機制。方法??將新西蘭兔分為正常組、假手術組、模型組、中藥組和陽性藥組，每組8只。采用改良的Hulth造模法建立兔膝骨性關節炎模型，成模后中藥組給予活血化瘀合劑（2.6?g/kg）灌胃，陽性藥組給予硫酸氨基葡萄糖溶液（15?mg/kg）灌胃，正常組、假手術組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，每日2次，連續28?d。末次給藥后，切除兔右后膝關節軟骨用于組織病理分析，分離血清及關節液，檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6含量，Western?blot檢測關節軟骨Toll樣受體4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）蛋白表達。結果??模型組兔關節軟骨存在淺表層纖維化，軟骨細胞成簇、肥大、排列紊亂、部分壞死，滑膜增厚，基質染色丟失等病理現象，血清和關節液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量較正常組和假手術組均顯著升高（P<0.05，P<0.01），軟骨TLR4、NF-κB蛋白表達顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，中藥組兔關節軟骨病理損傷得以緩解，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量均不同程度下降（P<0.05，P<0.01），TLR4、NF-κB蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結論??活血化瘀合劑能緩解膝骨性關節炎模型兔關節軟骨的損傷，其機制與抑制TLR4/NF-κB通路、降低炎癥因子水平有關。

關鍵詞：膝骨性關節炎;活血化瘀合劑;炎癥因子;關節軟骨;TLR4/NF-κB通路;兔

中圖分類號：R285.5????文獻標識碼：A????文章編號：1005-5304（2020）03-0039-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201907029

Effects?of?Huoxue?Huayu?Mixture?on?Inflammatory?Factors?and?TLR4/NF-κB?Pathway?in?Rabbit?Model?of?Knee?Osteoarthritis

YU?Yi，?PAN?Bo，?YANG?Dongmei，?ZHU?Jiale，?ZHAO?Hongqing，?WANG?Qianqian，?LU?Min，?YU?Wangyi

Hunan?University?of?Chinese?Medicine，?Changsha?410208，?China

Abstract：?Objective?To?observe?the?effects?of?Huoxue?Huayu?Mixture?on?inflammatory?factors?and?TLR4/NF-κB?pathway?in?rabbit?model?of?knee?osteoarthritis;?To?discuss?its?protective?mechanism?for?joints.?Methods?New?Zealand?rabbits?were?divided?into?normal?group，?sham-operation?group，?model?group，?TCM?group?and?positive?medicine?group，?with?8?rats?in?each?group.?A?rabbit?model?of?knee?osteoarthritis?was?established?by?modified?Hulth?modeling?method.?After?successful?modeling，?TCM?group?was?given?Huoxue?Huayu?Mixture?（2.6?g/kg）?for?gavage，?positive?medicine?group?was?given?glucosamine?sulfate?solution?（15?mg/kg）?for?gavage，?and?normal?group，?sham-operation?group?and?model?group?were?given?equal?volume?of?distilled?water?for?gavage，?twice?a?day，?for?28?d?After?the?last?administration，?the?right?posterior?knee?articular?cartilage?was?removed?for?histopathological?analysis，?and?serum?and?joint?fluid?were?separated?to?detect?the?levels?of?inflammatory?factors?TNF-α，?IL-1β?and?IL-6.?Western?blot?was?used?to?detect?TLR4?and?NF-κB?protein?levels?in?articular?cartilage.?Results?Rabbits?articular?cartilage?in?model?group?had?superficial?fibrosis，?chondrocyte?clustering，?hypertrophy，?disordered?arrangement，?partial?necrosis，?thickening?of?synovial?membrane，?loss?of?matrix?staining?and?other?pathological?phenomena.?The?levels?of?TNF-α，?IL-1β?and?IL-6?in?serum?and?joint?fluid?were?significantly?higher?than?those?in?normal?group?and?sham-operation?group?（P<0.05，

P<0.01），?and?the?expressions?of?TLR4?and?NF-κB?in?cartilage?increased?（P<0.01）.?Compared?with?the?model?group，?the?pathological?damage?of?rabbit?articular?cartilage?of?TCM?group?was?alleviated，?and?the?levels?of?TNF-α，?IL-1β，?and?IL-6?decreased?to?different?degrees?（P<0.05，?P<0.01）.?The?protein?expressions?of?TLR4?and?NF-κB?also?decreased?significantly?（P<0.05，?P<0.01）.?Conclusion?Huoxue?Huayu?Mixture?can?alleviate?the?damage?of?articular?cartilage?in?rabbit?model?with?knee?osteoarthritis，?and?its?mechanism?may?be?related?to?inhibiting?TLR4/NF-κB?pathway?and?reducing?the?level?of?inflammatory?factors.

Keywords：?knee?osteoarthritis;?Huoxue?Huayu?Mixture;?inflammatory?factors;?articular?cartilage;?TLR4/NF-κB?pathway;?rabbits

膝骨性關節炎是由于膝關節局部損傷、炎癥或慢性勞損引起的軟骨變性及活動障礙的慢性退行性骨關節病，常見于中老年人，我國55～64歲人群中患病率高達49%[1]。目前，膝骨性關節炎發病機制尚未完全闡明，通常認為炎癥因子在其發生發展過程中起到關鍵作用。炎癥因子過度表達能導致骨基質降解酶的大量釋放，引起軟骨組織損傷[2-3]。TLR4/NF-κB通路作為天然免疫模式識別，介導炎癥因子的表達，在多種免疫性疾病的發生發展過程中起著重要作用[4]。活血化瘀合劑由當歸、赤芍、姜黃3味中藥組成，前期臨床研究證實其治療膝骨性關節炎療效顯著[5]，但作用機制尚不明確。本研究采用新西蘭兔建立膝骨性關節炎模型，觀察活血化瘀合劑對軟骨組織病理形態及炎癥因子表達的影響，從免疫相關的TLR4/NF-κB通路著手，明確其治療膝骨性關節炎的具體分子機制，為其臨床應用提供依據。

1??材料與方法

1.1??動物

42只清潔級健康新西蘭兔，5月齡，體質量2.0～2.5?kg，雌雄各半，湖南中醫藥大學實驗動物中心代購，動物許可證號SYXK（湘）2015-0006。飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心，溫度（24±2）℃，相對濕度（65±10）%，光照12?h，噪聲<60?dB標準環境，自由攝食飲水。

1.2??藥物

活血化瘀合劑（當歸10?g，赤芍10?g，姜黃10?g），飲片均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，全方煎煮2次，合并煎液，濃縮至含1.3?g原藥材/mL，4?℃冰箱保存備用。硫酸氨基葡萄糖，新興同仁藥業有限公司，批號71610152。

1.3??主要試劑與儀器

腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（武漢華美生物，CSB-E09315Rb），白細胞介素（IL）-1β試劑盒（武漢華美生物，CSB-E06896Rb）、IL-6試劑盒（武漢華美生物，CSB-E06903Rb），TLR4一抗（美國CST，14358S），核因子-κB（NF-κB）一抗（美國CST，8242S），二抗（武漢博士德，BM3243）。切片機（德國Leica，RM223），倒置光學顯微鏡（德國Leica，DMi1），凝膠成像儀（德國Bio-Rad，ChemiDoc?XRS+），酶標儀（美國Thermo?Fisher?Scientific，MK3）。

1.4??分組、造模與給藥

將42只新西蘭兔隨機分為正常組（8只）、假手術組（8只）和造模組（26只）。造模組均采用改良的Hulth造模法建立兔膝骨性關節炎模型[6]。兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦（4?mL/kg）麻醉，固定，右側后腿膝關節常規脫毛、消毒，使膝關節屈曲，沿兔膝關節內側入路，使內側副韌帶及前交叉韌帶完全離斷。經前抽屜試驗、內側應力試驗驗證韌帶完全離斷后，充分沖洗創口，逐層縫合，術后連續3?d注射青霉素。假手術組從膝關節內側打開關節腔，但不破壞韌帶，而后直接縫合傷口，注射青霉素。造模后4周，行右后膝關節X線片證實模型是否成功。選取24只膝骨性關節炎模型兔，分為模型組、中藥組、陽性藥組，每組8只。中藥組給予臨床等效劑量活血化瘀合劑（2.6?g/kg），陽性藥組給予臨床等效劑量硫酸氨基葡萄糖溶液（15?mg/kg），正常組、假手術組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。給藥體積為5?mL/kg，每日2次，連續28?d。末次給藥后1?h麻醉，取血，于右后膝后髕上囊處常規脫毛，作長約0.5?cm的縱行切口，用1?mL生理鹽水灌洗關節腔3次后，收集關節液，而后切除右后膝關節軟骨，置于4%多聚甲醛中固定或保存于液氮中。

1.5??HE染色

取固定的兔關節軟骨，常規石蠟包埋后切片，經脫蠟、水化后進行HE染色，脫水、透明、封片，裝盒待用。鏡下觀察、拍照，分析病理損傷情況，進行Mankin評分[7]。

1.6??炎癥因子含量檢測

收集兔血液或關節液，4?℃、4000?r/min離心10?min，取上清液。嚴格按ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測血清及右膝關節液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.7??Western?blot檢測Toll樣受體4、核因子-κB蛋白表達

取兔關節軟骨組織，勻漿，測定總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，上樣，80?V恒壓電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，裁剪條帶，加入稀釋后一抗（GAPDH為內參），4?℃孵育過夜。洗滌條帶，加入二抗室溫孵育4?h，洗滌，顯影。采用Image?J成像軟件分析條帶灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.8??統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據以x（—）±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2??結果

2.1??HE染色結果

正常組兔關節軟骨結構清晰，表面光滑完整，細胞排列整齊，基質染色基本均勻;假手術組兔軟骨結構基本完整，細胞排列整齊，邊緣無缺損，滑膜厚度均勻;模型組兔軟骨淺表層纖維化，表面完整性被破壞，軟骨細胞成簇、肥大、排列紊亂，部分壞死，滑膜增厚，基質染色丟失;給予活血化瘀合劑或陽性藥治療后，兔關節軟骨表層不平整，偶見少量簇集的軟骨細胞，無壞死出現，滑膜稍微增厚，基質染色尚可。Mankin評分模型組較正常組和假手術組顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01），中藥組和陽性藥組較模型組顯著下降，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見圖1、表1。

2.2??活血化瘀合劑對模型兔血清及關節液中炎癥因子含量的影響

與正常組比較，假手術組兔血清及關節液炎癥因子含量無明顯變化;與正常組或假手術組比較，模型組兔血清及右膝關節液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著升高（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，中藥組和陽性藥組兔血清及關節液中炎癥因子含量明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結果見表2。

2.3??活血化瘀合劑對模型兔關節軟骨Toll樣受體4、核因子-κB蛋白表達的影響

正常組與假手術組兔關節軟骨TLR4、NF-κB蛋白表達無明顯差異;與正常組或假手術組比較，模型組兔關節軟骨TLR4、NF-κB蛋白表達明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，中藥組和陽性藥組兔關節軟骨TLR4、NF-κB蛋白表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結果見圖2、表3。

3??討論

膝骨性關節炎屬中醫學“痹證”范疇，是由風、寒、濕邪獨立或合而入侵致經絡閉阻、氣血不通而發生。該病多發于中老年人，由于長期勞損、氣血不足，累及筋骨關節，致氣血不和，瘀血內生，阻塞經絡，瘀熱互結，故而成痹。《醫林改錯》明確提出“痹有瘀血”，提示用活血化瘀法治療痹證。課題組前期運用活血化瘀法治療膝骨性關節炎亦取得良好療效，其中由當歸、赤芍、姜黃組成的活血化瘀合劑治療瘀阻脈絡、氣滯血瘀型關節炎療效尤為顯著。當歸、赤芍、姜黃三藥均有活血化瘀功效，不同程度地改善血液流變的性質，減輕關節內壓及骨內壓，減輕炎癥引起的關節液滲出及組織水腫，促進關節軟骨基質合成并加速關節損傷的修復。三藥合用，達到祛瘀生新功效。

膝骨性關節炎關鍵病理特征之一是軟骨細胞大量降解，而關節軟骨主要由細胞外基質組成，抑制基質降解和軟骨細胞凋亡被認為是治療膝骨性關節炎的關鍵[8-9]。研究表明，炎癥因子聚積能引發炎癥反應，進而導致骨基質降解酶的大量釋放，促進基質降解，同時促進軟骨細胞終末分化，誘導細胞功能喪失[10]。TNF-α和IL-6被認為是膝骨性關節炎早期發生發展過程中的關鍵炎癥因子，直接參與關節炎的發生;IL-1β也參與了該疾病的發生，通過增加滑膜液中TNF-α、IL-6的濃度而促進骨基質降解酶的釋放及軟骨細胞終末化。TLR4/NF-κB信號通路參與調控上述關節炎癥反應。TLR4是一種模式識別受體，識別包括脂多糖在內的多種配體，當與相應配體結合后，招募下游信號分子觸發一系列的信號級聯反應，最終活化NF-κB，從而促進炎癥因子基因表達的激活、炎癥因子產生和釋放。因而，抑制TLR4/NF-κB信號通路能降低炎癥因子的釋出，緩解膝骨性關節炎病理癥狀。

本研究中，膝骨性關節炎模型兔關節軟骨病理損傷明顯，軟骨細胞成簇肥大、排列紊亂，部分細胞凋亡甚至壞死，滑膜增厚，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著升高，TLR4/NF-κB通路活化明顯，與文獻[11]結果一致;經活血化瘀合劑治療后，模型兔TLR4/NF-κB信號受到抑制，炎癥因子水平降低，關節軟骨病理損傷狀況得以緩解。本研究明確了活血化瘀合劑通過調控TLR4/NF-κB通路，降低炎癥因子水平，發揮治療膝骨性關節炎功效，從炎癥因子角度明確活血化瘀合劑的作用環節及靶點，今后擬進行更廣泛的作用機制研究。

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（收稿日期：2019-07-02）

（修回日期：2019-08-15;編輯：華強）