香附水提液抑制百草枯致A549細胞株中毒反應的實驗研究

王翠香 劉春浩 于夢娟 王 靜 尹曉琳，*

(1.石家莊理工職業學院，河北 石家莊 050000；2.河北醫科大學，河北 石家莊 050000)

0 引言

百草枯(paraquat，PQ)是一種有效且廣泛使用的除草劑。但是，PQ中毒是一種非常嚴重的臨床疾病，致死率高，目前缺乏特效PQ解毒藥物[1]。一般來說，人類攝入PQ超過20mg/kg，就會導致死亡。短時間大量攝入PQ，快速導致多器官衰竭和休克，進而死亡。小劑量PQ攝入會在肺部累積，產生大量致肺部損傷的氧自由基，最終導致肺纖維化，而后死亡[2]。

香附，中藥名，莎草科植物莎草的根莖，具有疏肝解郁、理氣寬中、止痛調經的作用，相關研究表明此藥還具有解熱、鎮痛、抗炎的作用。本實驗擬將香附作用于百草枯中毒的肺上皮細胞株A549，通過檢測對A549細胞增殖、細胞因子TNF-α、TGF-β的表達及轉錄因子NF-κB表達的影響情況，初步探討香附是否對PQ作用下的A549細胞損傷抑制作用，為尋找治療百草枯中毒的中草藥提供初步的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥品

A549細胞株(河北醫科大學免疫教研室保存)香附，中藥店購買，本室制成水煎液備用[3]；百草枯(PQ)，山東三元工貿有限公司生產；兔抗人NADPH、p65抗體購自CST公司；CCK-8檢測試劑盒日本同仁化學產品；TNF-α、TGF-β ELISA試劑盒為Raybiotech公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 CCK-8法檢測 A549細胞的增殖

A549細胞用10%FBS 1640RPMI培養基于37℃，5% CO2的培養箱中傳代。收獲細胞后，以5×103/孔的濃度接種96孔板，每孔100μl細胞懸液，加入不同濃度的PQ和香附提取液，將培養板在培養箱中培養24h后，吸棄上清，每孔加入含10μl CCK-8試劑的培養基100μL，將培養板在培養箱內再次孵育1.5h。

1.2.2 western-blot法檢測A549細胞NF-κB P65的表達

將A549細胞以3.75×105/2mL/孔的濃度接種于6孔板，培養24h，加入不同濃度的PQ和香附提取液，于30min、1h、2h收集細胞，western-blot法檢測NF-κB P65的表達。

1.2.3 ELISA法檢測細胞培養上清中TNF-α、TGF-β、FN的表達

將A549細胞以5×104/1mL/孔的濃度接種于12孔板，加入含有不同濃度PQ和香附提取液的培養液，培養24h后，吸取上清。用ELISA方法檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)、轉化生長因子β(TGF-β)、纖連蛋白(FN)的表達。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 香附水提液對百草枯作用的A549細胞增殖的影響

為評估PQ的細胞毒性，我們用不同濃度的PQ(0～1.0mM)作用于A549細胞24h,用CCK-8試劑檢測A549細胞的增殖情況，見圖1A，從PQ0.2mM開始，細胞出現明顯死亡現象。因此，我們選擇0.3mM的PQ濃度作為PQ誘導細胞死亡的試驗濃度，評價香附對PQ對A549細胞死亡的影響。另外，評價不同濃度的香附(0～8mg/mL)對A549細胞有無毒性。結果見圖1B，不同濃度的香附對A549細胞的增殖無明顯影響。但對PQ對A549細胞的毒性有一定的調節作用，見圖1C，與對照組相比不同濃度的香附水提取液對百草枯所致的細胞損傷均有一定的保護作用，但各濃度間無顯著差異。

2.2 香附水提液對PQ中毒的A549細胞NF-κB-P65表達的影響

經過試驗，我們評價了香附及PQ對A549細胞轉錄因子NF-ΚB-P65表達的影響。結果顯示，0.3mM的PQ作用于A549細胞后，NF-ΚB-P65表達在不同時間段變化不明顯，但在2h時稍有降低。1mg/mL的香附作用于加入PQ的A549細胞后NF-ΚB-P65表達也無明顯改變，見圖2。

Western Blot結果顯示，PQ作用于A549細胞0.5h、1h、2h后P65蛋白的表達與對照組相比明顯增高，但各時間段之間比較無明顯差異，2h的表達稍有減少。而加入香附后，在1h的時候，P65的表達量比單獨PQ作用表達量減少，2h表達量不明顯。

(a)不同PQ濃度對A549細胞增殖的影響 (b)不同香附濃度對A549細胞增殖的影響 (c)香附對A549細胞PQ中毒的調節作用

PQ：百草枯；X：香附，數字代表香附的含量(mg/mL)

圖1 PQ和香附對A549細胞的增殖的影響

圖2 香附對NF-κB信號通路的調節作用 PQ：百草枯；CR：香附

2.3 香附水提液對PQ中毒的A549細胞TNF-α、TGF-β表達的影響

用ELISA方法檢測A549細胞經PQ和香附作用24h上清中TNF-α和TGF-β的表達水平。結果顯示香附能促進PQ0.3mM作用的A549細胞 TNF-α的表達，見圖3，TGF-β未檢測出來。

圖3 香附對PQ中毒的A549細胞產生TNF-α的影響

3 討論

百草枯是農藥中常見的除草劑,但對人是高毒性的藥物,尤其是對肺的損傷更為嚴重,低劑量即可導致死亡。

A549是人的肺上皮細胞株，廣泛用于肺損傷和肺纖維化研究的細胞模型[4-5]。本研究首先用不同濃度的百草枯和香附分別作用于A549細胞，PQ在0.3mM開始至1mM濃度以濃度依賴方式引起細胞死亡，而香附在所使用濃度范圍內(1～8mg/mL)對A549細胞內均無致死毒性。其次，再以0.3mM的PQ濃度作為A549細胞的中毒濃度，再與不同濃度的香附共同作用于A549細胞，發現不同濃度的香附均能緩解PQ對A549細胞的致死作用。因此，可以認為香附提取液能有效緩解低劑量的PQ對A549細胞的致死作用，并可通過調節肺上皮細胞來延緩肺纖維化，這給我們的動物實驗結果提供了證據[5]。

NF-κB這一轉錄因子參與炎癥反應、免疫反應等多種生物進程[6-7]。研究發現，其在百草枯導致肺纖維化的過程中也起著重要的調控作用[8]。NF-κB是氧化應激敏感型轉錄因子，它在靜息狀態下不具有生物活性，百草枯中毒后產生大量的自由基、大量炎癥細胞及細胞因子。這些物質可直接激活或間接活化 NF-κB。被激活的NF-κB進入細胞核增強促纖維化細胞因子基因的表達，使α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的肌成纖維數量增多，進而發揮促肺纖維化的作用。因此，實驗用香附作用于PQ中毒的A549細胞，檢測NF-κB-p65的表達。但結果顯示NF-κB-p65在2h內未發現明顯的表達變化。推測原因，一是作用時間較短。二是香附沒有對該轉錄因子的調節作用，有待于進一步研究加以證實。

研究證明PQ引起染毒人和動物肺纖維化的重要機制之一是炎癥反應學說。其中TNF-α、TGF-β在PQ感染時，經NF-κB激活后產生，促進成纖維細胞活化、增殖和成熟分化，刺激其合成大量膠原蛋白，導致肺纖維化形成。因此，本實驗中檢測了香附對PQ中毒的A549細胞2種細胞因子作用的影響，發現香附能促進A549細胞TNF-α的分泌，而對TGF-β的產生無影響。本結果與文獻中動物試驗結果不同[5]，其原因可能是在人體或動物體內TNF-α的產生來源不完全是肺上皮細胞，還有巨噬細胞等其他細胞，或者香附在體內的調節作用也不只是一種細胞，這有待于進一步研究。

總之，本研究證明了PQ可直接造成非上皮細胞的損傷，香附具有緩解PQ對細胞的毒性作用，但其機制還需要進行更深入的研究加以證實。