銅陵地區腦卒中病人MTHFR C677T 基因多態性分布及同型半胱氨酸水平分析

朱娟娟，崇慧峰，胡志軍，吳寶明，潘曉龍，李旭光，唐吉斌

腦血管病是我國成年人致死和致殘的首位原因，《中國腦卒中防治報告2018》概要指出，由于社會老齡化及不健康生活方式的流行，我國腦卒中有爆發式增長的態勢，并且呈現出性別和地域差異明顯以及年輕化的趨勢［1］。血液中同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）水平增高被認為是腦卒中發病的風險因素之一［2］，其水平的增高受非遺傳因素和遺傳因素的影響：葉酸缺乏及糖攝入增加是常見的導致Hcy水平增高的非遺傳因素，而5，10-亞甲基四氫葉 酸 還 原 酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）活性下降是導致Hcy水平增高的主要遺傳性因素之一［3］。

MTHFR是Hcy代謝與葉酸代謝中的關鍵酶，它可催化5，10-亞甲基四氫葉酸使血中Hcy 發生甲基化，維持其在血中的水平。MTHFR C677T基因多態性是由第677 位的點突變導致的，突變導致的酶活性下降可引起高Hcy血癥［4］。

目前關于MTHFR C677T 基因多態性與腦卒中的關系越來越引起人們的重視，但由于其基因分布頻率受地域和種族影響［5］，研究結果尚有爭議，本研究以銅陵地區腦卒中人群作為研究對象，分析該人群MTHFR C677T基因多態性分布及Hcy水平，探討腦卒中發生的風險因素并為其個體化防治提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年10月到2019年4月銅陵市人民醫院住院的腦卒中病人234 例為研究對象，均為長期居住本地的漢族人。經頭顱CT或MRI檢查，符合中華醫學會第四屆全國腦血管病學術會議提出的各項腦血管病診斷標準，其中出血性腦卒中82 例，缺血性腦卒中152 例；男性140 例，女性94例；年齡范圍為23～92歲，年齡69歲，234例病人均進行MTHFR C677T基因多態性檢測，其中227例進行了Hcy檢測。選取同時間段無冠心病、高血壓、腦血管病于醫院其他科室69例住院病人為對照組，其中男性35例，女性34例；年齡范圍為22～88歲，年齡55 歲，69 例對照組均進行MTHFR C677T 基因多態性檢測，其中67例進行了Hcy檢測。記錄研究對象身高、體質量、有無高血壓史，并計算體質量指數（Body Mass Index，BMI）。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑 PyroMark Q24 焦磷酸測序儀（德國凱杰公司），高速低溫離心機（德國赫擔馳公司），基因擴增儀（北京東勝創新生物科技有限公司），全血基因組提取試劑盒及測序反應通用試劑盒（長沙三濟公司），基因擴增試劑（日本Takara 公司），擴增引物（上海捷瑞生物工程有限公司），全自動生化分析儀（德國西門子公司），Hcy 檢測試劑盒（安徽大千生物工程有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本采集 清晨采集受試者空腹靜脈血標本，乙二胺四乙酸二鉀鹽（EDTA dipotassium salt，EDTA-K2）抗凝血2 mL 用于基因測序，未抗凝血2 mL待充分凝固后離心留取血清用于Hcy檢測。

1.3.2 全血基因組DNA 提取 采用柱式法從外周血細胞中將基因組DNA提取純化，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，提取后的DNA 可短期保存于2～8 ℃或長期凍存于-20 ℃和-80 ℃。

1.3.3 PCR 擴增 PCR 擴增反應體系含樣本DNA 2 μL、Taq 酶0.5 μL、正向引物和反向引物各1 μL、緩沖液5μL、dNTP 3μL，最后用純水補足總反應體系50μL。擴增條件為：94 ℃5 min，94℃25 s，56 ℃25 s，72 ℃25 s，共35 個循環，72 ℃5 min 后擴增產物可進行測序。

1.3.4 基因測序 通過PyroMark Q24MDx系統采用焦磷酸測序法測定MTHFR C677T位點，確定各樣本基因型。

1.3.5 Hcy檢測 酶循環法檢測血清Hcy水平。

1.4 統計學方法 使用SPSS 22.0 進行統計分析，定性資料的描述使用百分比，統計推斷使用χ2檢驗，定量資料不服從正態分布時，統計描述使用中位數和四分位數間距，三樣本之間的比較使用Kruskal-Wallis H檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義，兩樣本之間的比較使用Mann-Whitney U 檢驗，組間兩兩比較時校正后的檢驗水準α＝0.05/3＝0.017，同時以Hcy 為因變量進行多元線性回歸分析，評價基因型、性別、年齡、BMI等對Hcy水平的影響。

2 結果

2.1 MTHFR C677T 基因型檢測結果分析 PCR產物經焦磷酸測序后，儀器測得峰高與檢測位點結合模板的堿基數量成正比，經軟件處理后自動轉化為序列信息，確定該樣本攜帶的基因型。見圖1。

圖1 MTHFR C677T基因測序結果分析圖：A為野生純合型（CC），B為雜合突變型（CT），C為純合突變型（TT）

2.2 MTHFR C677T 基因型頻率及等位基因頻率 如表1所示，本研究中腦卒中組MTHFR C677T的野生純合基因型（CC）、雜合突變型基因型（CT）和純合突變型基因型（TT）的分布頻率分別為31.2%、48.7%和20.1%，腦卒中組TT 基因型頻率高于對照組TT基因型頻率，差異有統計學意義（P＜0.05），而CC、CT 基因型頻率在兩組中分布差異無統計學意義（P＞0.05）；腦卒中組和對照組T等位基因分布頻率分別為44.4%和33.3%，腦卒中組T等位基因分布頻率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。如表2 所示，在腦卒中組中，不同性別的病人MTHFR C677T基因型和等位基因頻率分布差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 MTHFR C677T 基因型及等位基因的分布頻率/例（%）

表2 MTHFR C677T 基因型在不同性別腦卒中病人中的分布頻率/例（%）

2.3 MTHFR C677T 基因型與Hcy 水平的相關性 如表3 所示，在腦卒中組中，TT 基因型病人的Hcy 水平高于CC 基因型和CT 基因型，差異有統計學意義（P＜0.01），而對照組三種不同基因型之間Hcy 水平差異無統計學意義（P＞0.05）。將腦卒中組和對照組同種基因型的Hcy 水平進行比較，可以看出腦卒中組Hcy 水平均增高，其中TT 基因型的Hcy水平在兩組間有差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 MTHFR C677T 基因型與血清Hcy水平的關系/（μmol/L）

2.4 Hcy水平與其他變量的多元線性回歸 以Hcy為因變量，MTHFR C677T 不同基因型、性別、年齡、有無高血壓史和BMI 為自變量進行的多元逐步分析結果顯示，僅基因型、性別、高血壓史與Hcy 存在顯著的線性關聯，回歸結果見表4，當基因型由野生型（CC）向雜合突變（CT）及純合突變（TT）的轉化時，Hcy水平也會隨之增加，男性和有高血壓的病人Hcy水平也會增加。

表4 影響同型半胱氨酸水平的多元線性回歸分析

3 討論

腦卒中具有發病率高、致殘率高、死亡率高和復發率高的特點［6］，可造成個人及國家的大量醫療支出，如能采取有效的措施早期干預其發病的危險因素，可顯著降低致殘率和致死率。

血液中高濃度的Hcy 會干擾血管內皮細胞功能，導致凝血和纖溶系統異常，使機體處于血栓前狀態，也可作用于內皮細胞，使血管收縮，血壓上升，促使動脈粥樣硬化形成，增加腦血管病的發生風險［4］。有研究認為高Hcy血癥是獨立于高脂血癥、高血壓、糖尿病、吸煙和年齡之外，引發心血管疾病的一個獨立的危險因素［7］。但也有文獻指出目前國外的許多心血管疾病指南均未把高Hcy血癥作為心血管病的危險因素，并不贊同高Hcy血癥是心腦血管疾病的獨立危險因素的說法［8］。總體來說，國內的大多研究認為高Hcy血癥是影響高血壓病人心血管病預后的重要危險因素［9］。降低血中Hcy水平可有效減低腦卒中的發病風險且改善急性腦梗死病人預后［10-11］。

MTHFR 是影響血中Hcy 水平的主要遺傳性因素之一，它是葉酸代謝過程中的關鍵酶［12］，MTHFR C677T是目前研究最多的基因多態位點，由于第677位的堿基胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）置換導致，導致其編碼產物由丙氨酸被纈氨酸替代，從而影響酶的活性。這種點突變可產生三種基因型，分別是野生純合型CC，雜合突變型CT，純合突變型TT，CT型的酶活性是CC 型的65%，TT 型的活性僅為CC 型的30%［13］。目前，MTHFR C677T基因多態性與腦卒中相關性的研究很多：Li 等［14］指出中國人群MTHFR C677T 基因多態性與缺血性腦卒中發病相關，可能是由于其影響血中Hcy 水平所致；Zhao 等［15］認為在中國高血壓病人中，MTHFR C677T基因型和葉酸補充與Hcy 對第一次卒中的影響密切相關，而且葉酸干預能顯著降低CC和CT基因型病人由高Hcy導致的卒中風險，提示可根據個體遺傳背景和營養狀況對腦卒中進行防治；張露等［16］卻認為MTHFR C677T 基因突變可能與缺血性腦卒中無關；王超等［17］的研究也表明MTHFR C677T 基因在腦卒中組和健康人群組中的分布沒有差異。造成研究結果差異的原因可能是由于研究樣本量和分析方法不同導致，也有可能是研究人群具有不同遺傳背景和營養狀況導致，據報道中國人群具有較高的MTHFR C677T的突變頻率［13］，且由于飲食烹飪習慣的原因導致大部分中國成年人（尤其在北方）葉酸攝入較低［1］，會導致較高的Hcy水平和腦卒中發病風險。

本研究中安徽銅陵地區腦卒中人群MTHFR C677T突變的T等位基因頻率為45.1%，低于黑龍江地區［17］，高于廣州地區［18］，說明該基因有一定的地域特點。腦卒中組MTHFR C677T 突變基因T 的頻率高于對照組，提示在銅陵地區腦卒中可能與MTHFR C677T基因多態性相關。有報道指出MTHFR C677T 基因多態分布有性別差異［19］，但本研究中并未體現。在將腦卒中組和對照組進行同種基因型Hcy 水平的比較時發現，腦卒中組均具有較高的Hcy水平，尤其TT基因型Hcy水平增高差異有統計學意義，提示當TT基因型和高Hcy的同時存在時腦卒中有較高的發病風險。腦卒中組三種基因型中TT基因型的Hcy水平高于其他兩種基因型，可能是由于純合突變的基因導致酶活性明顯下降所致。對影響Hcy水平的其他因素進行多元線性回歸結果顯示，除了MTHFR C677T 的基因型，性別及高血壓史也會對Hcy 水平造成一定影響，這也就解釋了對照組三種基因型之間Hcy 水平無明顯差異的原因，除了MTHFR C677T基因多態性，Hcy水平還可能受性別和血壓情況等多種因素的影響。由于本研究是回顧性研究，研究對象葉酸攝取情況無法獲得，因此進一步擴大研究樣本量并對病人葉酸攝取情況進行問卷調查是我們接下來要做的工作。

綜上所述，本研究結果表明，銅陵地區腦卒中病人具有較高的MTHFR C677T基因的突變頻率和Hcy水平，可能是腦卒中發病的風險因素。進行MTHFR C677T基因多態性和Hcy水平的檢測有助于篩選腦卒中高危人群，并有望根據基因型及Hcy水平進行不同劑量的葉酸補充，即個體化地指導腦卒中的一級預防和藥物治療，可極大地減輕病人和社會的負擔。