實體組織外泌體相關基因參與肝細胞癌病變的分析*

盧東軍 楊武佳 潘沙沙 盧佳佳 闞 寵 黃小程 阮文慧 唐玉蓮 倪安妮 李根亮

右江民族醫學院，廣西百色市 533000

中國肝癌年發病率為20～40/10萬，肝癌患者總數占全球的一半。肝癌患者死亡率居于惡性腫瘤第2位，嚴重危害人體健康，每年有30余萬中國人死于肝癌[1]。外泌體(exosome)是一種通過細胞內多泡體與細胞膜融合產生的納米級細胞外膜泡，可以在血清、乳汁、尿液等多種體液中檢出[2]。卵巢、乳腺、前列腺、結直腸等許多器官的癌變組織和細胞都能分泌外泌體，且癌細胞對外釋放的外泌體量遠高于正常細胞[3-4]。外泌體在細胞間起提呈、傳遞物質信息等作用，在細胞的生理、病理過程中扮演著重要角色。此外，外泌體還參與了腫瘤局部微環境的構成及生理調控，影響著腫瘤的生長及發展[5]。肝癌微環境中的外泌體可通過表面膜分子成分作用于臨近細胞或遠端靶向細胞，并通過受體配體及胞吞作用調控靶細胞的功能，從而參與癌癥的發生[6]。近年來，越來越多的人研究了體液外泌體參與癌癥發生的途徑，一些外泌體蛋白質標志物已被用于癌癥的早期診斷和預后復發風險的評估[7]。但實體組織外泌體的研究，則由于提取方法的煩瑣而研究者相對較少，尤其是實體組織外泌體參與癌癥發生的機制還有待進一步研究。

本研究以肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)模型小鼠的瘤體組織和癌旁組織為實驗材料，通過RNA-seq和生物信息學等手段，分析比較兩類樣本中外泌體相關組分的分布及其在HCC中的可能功能，探討實體組織外泌體在HCC發生中的可能作用，研究結果對理解實體組織外泌體參與HCC發生機制具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 外泌體相關差異表達基因篩選 以“exosome、tissue和Mus musculus”為關鍵詞，在NCBI數據庫中檢索，檢索結果與本實驗室前期測序數據中的差異表達基因進行比較，篩選出在瘤體組織和癌旁組織兩類樣本中差異表達泌體相關基因。

1.2 外泌體相關差異表達基因的功能分析 利用DAVID 6.8在線軟件對實體組織外泌體相關差異表達基因進行功能富集分析。

1.3 外泌體相關差異表達基因編碼蛋白的互作分析 通過STRING 11.0版本在線對實體組織外泌體相關差異表達基因編碼蛋白進行互作分析，以評價基因功能上的相關性。

1.4 外泌體相關差異表達基因的RT-qPCR 隨機選擇4個實體組織外泌體相關差異表達基因，參照本實驗室之前的RT-qPCR反應條件及計算方法分析基因在樣本中的相對表達量[8]。引物采用Primer-Blast軟件設計，并由上海生工有限公司合成。

2 結果

2.1 外泌體相關差異表達基因的篩選和功能分析結果 通過比對分析，我們共篩選出20個實體組織外泌體相關差異表達基因，即Car4、PFKL、CD63、FN1、DBI、DUT、wisp2、ADAM15、LAP3、SERPINA5、LGALS3、GPRC5C、ECH1、EXOSC9、FAS、IL6RA、TNFRSF1B、HGF、TNFRSF10B、LMO7。這些基因共被富集到1個BP(生物學過程)、5個CC(細胞組分)、2個MF(分子活性)和1個KEGG信號通路(見圖1)。從5個CC可以看出，大量實體組織外泌體相關差異表達基因分布于細胞表面、細胞外空間、細胞外區域、頂質膜等部位。富集到的BP為細胞粘連，MF為整聯蛋白結合和蛋白酶結合，信號通路則為癌癥中的蛋白聚糖，且有18個基因，即Car4、PFKL、CD63、FN1、DBI、DUT、WISP2、ADAM15、LAP3、SERPINA5、LGALS3、GPRC5C、ECH1、EXOSC9、FAS、IL6RA、TNFRSF1B、HGF具有糖基化位點。另外，功能富集結果顯示，一些實體組織外泌體相關差異表達基因還參與其他多種生理功能，如LGALS3、FN1和WISP2等參與胞外基質的構成，CD63和FN1參與細胞—基質粘連過程；FAS和TNFRSF1B具有腫瘤壞死因子激活受體活性且參與非固有凋亡信號通路；LGALS3和HGF具有趨化黏附活性，并與FN1和FAS等一起參與細胞凋亡程序的負調控。

2.2 外泌體相關差異表達基因編碼蛋白的互作結果 實體組織外泌體相關差異表達基因編碼蛋白的互作關系見圖2。

2.3 外泌體相關差異表達基因的RT-qPCR和RNA-seq的結果比較 RT-qPCR與RNA-seq的數據比較顯示，兩種方法所得結果一致。相關差異表達基因的RT-qPCR引物及在HCC中的表達情況分別見表1和圖3。

圖1 肝癌微環境中實體組織外泌體相關差異表達基因的生物學功能

圖2 肝癌微環境中實體組織外泌體相關差異表達基因編碼蛋白的互作關系

表1 基因RT-qPCR引物

圖3 實體組織外泌體相關差異表達基因RT-qPCR與 RNA-seq分析

X軸表示不同的差異表達基因，Y軸表示差異表達基因表達的相對比率的基數10對數

3 討論

本研究通過從NCBI數據庫中檢索實體組織外泌體相關基因，與測序數據比較，篩選出實體組織外泌體相關差異表達基因。通過功能富集發現，這些差異表達基因主要存在于細胞表面和細胞外區域，參與的生物學過程主要是細胞粘連，且這個過程與癌癥中的蛋白多糖信號通路相關。有研究報道，蛋白多糖可以調節細胞粘附和運動，影響細胞內的膜運輸[9]。此外，我們的富集結果還顯示，這些基因涉及的分子活性主要是整聯蛋白結合和蛋白酶結合。整聯蛋白作為跨膜接頭在細胞外基質和細胞內肌動蛋白骨架之間起雙向聯絡作用，可將細胞外基質同細胞內的骨架網絡連成一個整體，起細胞粘著作用。我們富集到的信號通路是癌癥中的蛋白聚糖。蛋白聚糖是細胞外基質的主要成分，肝臟的病變會導致蛋白多糖的過度合成,在實體瘤和造血系統惡性腫瘤的發展過程中影響癌細胞的行為及其微環境[10]。外泌體生物發生的過程允許包裝來自膜和胞質來源的分子[11]。

在肝癌微環境中，外泌體可被其他細胞攝入和內化，并傳遞具有一定功能的基因，協助腫瘤細胞與基質細胞間進行信息傳遞及物質交換,促進腫瘤的增殖及遠端轉移[12]。我們的研究發現，實體組織外泌體相關差異表達基因在參與肝癌發生的過程中，還可能涉及胞外基質的構成、細胞—基質粘連、腫瘤壞死因子激活受體參與人非固有凋亡信號通路、趨化黏附及細胞凋亡程序的負調控等生物學功能。近年來,也有研究報道外泌體可作為新的信號傳遞載體，攜帶蛋白質、DNA、RNA、miRNA和脂類等物質,介導細胞與細胞之間、組織與組織之間的相互作用[13]。而且腫瘤細胞分泌的外泌體，還可以改變靶組織的微環境，介導腫瘤細胞的遷移,進一步實現癌癥的轉移[14]。人類肝癌細胞分泌的含有多種miRNA的外泌體可減弱其他肝癌細胞中轉化生長因子β的信號途徑中相關蛋白質的表達,顯著促進肝癌細胞的生長[15]。

綜上所述，在肝癌微環境中，實體組織外泌體相關基因存在于細胞表面、細胞外空間、細胞外區域和頂質膜上，通過細胞粘連以及癌癥中的蛋白多糖為信號通路，發揮整聯蛋白結合、蛋白酶結合的分子活性，參與了肝癌微環境的形成和發展。據此我們推測，隨著研究的不斷深入，運用實體組織外泌體對肝細胞癌進行診斷將有助于對肝癌的防治。