染色體核型分析聯合快速MLPA非整倍體技術在產前診斷中的應用

鄧國生

(廣西壯族自治區玉林市婦幼保健院 檢驗科，廣西 玉林537000)

染色體核型分析技術是檢查人類染色體金標準方法，但染色體核型分析技術要細胞培養，檢測時間長，操作程序復雜，技術要求高，2002年荷蘭White和Schouten創建了多重鏈接依賴性探針擴增技術(MLPA)[1-3]，MLPA不用細胞培養，是一種快速簡單的檢測方法。為了探討染色體核型分析聯合MLPA非整倍體技術在產前診斷中的應用價值，對2000例有產前診斷指征孕婦羊水，分別采用染色體核型分析和MLPA非整倍體技術檢查，結果總結如下。

1 資料與方法

1.1 資料

2018年1月至2018年6月，在玉林市婦幼保健院優生遺傳科就診的2000例有產前診斷指征孕婦，同意行羊膜腔穿刺抽取羊水，并簽署知情同意書。其孕周在18-24周，年齡在(16-45)歲之間。進行染色體檢查及MLPA非整倍體檢測。

1.2 儀器與試劑

儀器：黑馬TGL-16H臺式高速離心機，K30B干式恒溫器，PCR梯度擴增儀，ABI 3500基因分析儀，美國Formar CO2培養箱，潔凈工作臺。試劑：DNA提取液，荷蘭MLPA試劑盒(P095)，廣州白云山羊水培養基、美國張氏培養基。

1.3 羊水細胞培養、制備及染色體核型分析

在羊水穿刺前均告知孕婦及其家屬進行羊水染色體分析的產前診斷范圍與風險，并簽署知情同意書。在無菌條件下，經B超引導定位下行羊膜腔穿刺術，抽取羊水26 ml，分別置于3支15 ml無菌離心管中，其中1支6 ml羊水送至分子遺傳實驗室做MLPA P095檢測。1 500轉/分離心10 min，在超凈工作臺無菌操作，去上清液后分別加入5ml兩種不同廠家培養基，用無菌吸管吹打混勻，并分別放入兩個不同廠家培養瓶于兩個獨立的37℃5%CO2培養箱培養7-8天，在倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞克隆大小并進行換液，繼續培養1-2天后觀察發現有6-8個集落均為圓形透亮的細胞時加入秋水仙素阻斷，收獲、制片和G顯帶，并進行核型分析。根據人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2013)標準進行描述染色體核型，并出具染色體核型分析報告。

1.4 MLPA方法

按羊水的DNA提取、PCR擴增、毛細管電泳及結果分析等步驟進行[4]。

2 結果

2.1 羊水細胞染色體核型分析

羊水染色體培養2000例，培養成功率100%，其中檢測出異常染色體62例，檢出率31.00‰，異常染色體中數量最多前6位為47,Xn,+21核型18例;47,Xn,+18核型6例;46,X,inv(Y)(p11q11)核型4例;45,Xn,der(13;14)(q10;q10)核型2例;47,XYY核型2例;46,Xn,del(22)(p11.2)核型2例。結構異常22例，嵌合體12例。見表1。

2.2 多重鏈接依賴性探針擴增技術非整倍體檢查

羊水MLPA檢測2000例，檢測成功率100%，檢測出異常染色體31例，陽性率15.50‰，其中47,Xn,+21核型18例;47,Xn,+18核型7例;47,Xn,+13核型1例;47,XXY核型 1例;47,XYY核型 2例;45,X嵌合體1例;47,XXY嵌合體1例。見表2。

3 討論

本研究表明，可以看出MLPA檢測21、18、13、X、Y染色體非整倍體時，結果與核型分析100%符合，易倍型18三體與核型分析100%符合，45,X嵌合體、47,XXY嵌合體也與核型分析100%相符合。MLPA對于染色體平衡易位、一些非平衡易位、倒位等檢測不出。染色體核型分析檢測有產前診斷指征孕婦異常染色體核型檢出率31.00‰遠遠高于MLPA檢測檢出率15.50‰。MLPA檢測盡管能快速檢測也不能完全替代金標準染色體核型分析技術檢測，二者結合檢測可以免去染色體核型分析技術檢測不成功之擾，MLPA檢測結果也經染色體核型分析技術檢測驗證，提高染色體檢測準確率，對提高人口出生質量有重要意義。

表1 羊水染色體核型異常結果

染色體核型分析檢測結果準確可靠，可檢測人類染色體倍數改變，也可以檢測染色體缺失、重組等結構改變，是染色體產前診斷一項金標準檢測方法[5,6]，但染色體核型分析技術要細胞培養，檢測時間長，操作程序復雜，技術要求高，往往有檢測不成功案例。根據作者李金鴿等[7]報道，對西安地區72例流產絨毛組織染色體核型分析，培養未成功20例，培養未成功率為27.78%。根據作者黃和明等[8]報道，對286稽留流產患者絨毛組織的染色體核型分析，培養未成功24例，培養未成功率為8.39%。根據作者胡道琴等[9]報道，對116例稽留流產患者絨毛細胞染色體核型分析，培養未成功5例，培養未成功率為4.31%。根據作者雷冬竹等[10]報道，對湖南郴州地區106例自然流產絨毛細胞染色體核型分析，培養未成功4例，培養未成功率為3.77%。根據作者李艷華等[11]報道，對有產前診斷指征孕婦羊水650例進行染色體核型分析檢測,培養未成功16例，培養未成功率為2.17%。根據作者蔡美英等[12]報道，對960份胎兒臍帶血進行染色體核型分析檢測,有10份臍帶血培養未成功,未成功率為1.04%。

MLPA技術是一種針對靶核酸序列進行定性和定量分析技術，從DNA提取至檢測結果時間僅要1至2個工作日，一個反應可對多達50個基因目標位點的重復、缺失、單核苷酸多態性等進行檢測[13，14]，其原理為基因捕獲+PCR+毛細管電泳分離，設備自動化程度高，設有質控探針，可檢測實驗過程中出現問題，確保實驗結果準確性，同時可檢測幾十個樣本，具有快速、高通量的優勢。

MLPA技術無法對染色體的結構異常以及部分嵌合體、缺失、三倍體少見染色體的數目的變化檢測[15]，本研究采用MLPA技術檢測，檢測出異常染色體31例，而采用染色體核型分析檢測，檢測出異常染色體達62例，用MLPA技術少檢測50%異常染色體，故不能單獨用一種方法檢測。MLPA技術檢測，檢測標本細胞至少需要3000個，不能用于單細胞檢測，MLPA技術無法檢測染色體平衡易位，MLPA帶有的端粒特異性檢測探針可以檢測絕大部分的染色體不平衡易位[16]，當有母體細胞污染可能會導致結果判斷錯誤。因此，快速MLPA檢測聯合染色體核型分析實現優勢互補,提高產前胎兒染色體異常檢出率和準確率，為產婦提供準確的胎兒染色體信息，提高優生指導服務，提高人口出生質量，具有良好的臨床應用價值。