傾向性評分匹配分析口咽癌PD-L1的表達與HPV感染及預后的相關性研究

高立明，朱瑩瑩，師曉華，陳興明*

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 1.耳鼻咽喉科;2.病理科,北京100730)

口咽癌為頭頸部常見惡性腫瘤之一，90%以上為鱗狀細胞癌[1]。人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染已成為除吸煙和飲酒外口咽癌的又一重要致病因素[2]。全球每年約有32%的口咽癌(主要包括扁桃體癌及舌根癌)由HPV感染導致[3]。歐美國家相關研究發現HPV陽性的口咽癌患者其臨床預后較HPV陰性者更好[2,4]。同時，最新的臨床試驗表明，HPV陽性和HPV陰性頭頸部鱗癌患者對免疫治療的反應存在差異[5,6]，提示HPV陽性及HPV陰性頭頸腫瘤的免疫逃避機制可能不同。然而，程序性細胞死亡配體1(programmed death ligand 1，PD-L1)在口咽癌中的臨床意義尚不明確。本研究旨在探討PD-L1在口咽癌中的表達情況，分析其與HPV感染狀態及臨床預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2008-2014年我院收治的確診為口咽鱗癌(原發灶為扁桃體或舌根)患者的臨床資料，納入50例HPV陽性的口咽癌患者，使用傾向性評分匹配(Propensity score matching，PSM)方法1∶1匹配納入50例HPV陰性口咽癌患者，所有患者按照2010年美國癌癥聯合委員會(AJCC)指定的TNM分級標準確定TNM分期。所有患者進行超過5年的長期隨訪或直至出現死亡。

1.2 PD-L1免疫熒光染色

采用常規方法制備5 μm厚的石蠟切片，進行免疫熒光染色，EDTA緩沖液中進行微波抗原修復，PD-L1一抗4℃過夜孵化，洗滌后孵育熒光標記二抗，DAPI復染，熒光防淬滅劑封片后熒光顯微鏡觀察染色并照相記錄。膜性表達PD-L1的腫瘤細胞占所有腫瘤細胞的比例≥ 5%定義為PD-L1陽性。

1.3 統計學方法

本研究采用1∶1的比例運用PSM方法對50例HPV陽性口咽癌患者進行匹配，匹配因素包括年齡、性別、吸煙、腫瘤、原發灶、治療方式及分期。所有二分類變量用χ2檢驗(或Fisher精確檢驗)分析；有序分類變量用 Mann-Whitney 秩和檢驗分析。運用 Kaplan-Meier 法進行總生存率(overall survival，OS) 及疾病特異性生存率 (disease-specific survival，DSS)單因素分析，采用Cox比例風險模型進行多因素分析。以上所有分析均使用SPSS 22.0進行，均為雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

100例口咽癌患者的年齡、性別、吸煙、飲酒、合并癥、分化程度、分期及治療方法等臨床資料見表1，兩組各匹配因素無明顯統計學差異。

隨訪時間為13-113個月，中位隨訪時間在HPV陽性組和HPV陰性組分別為67個月和47.5個月。隨訪期間共有53例患者死亡，45例患者死于口咽癌。HPV陽性組及HPV陰性組5年總生存率分別為66%和40%(P=0.003)，5年疾病特異生存率分別為73% 和44%(P=0.001)，兩組間差異具有統計學意義。采用COX多因素回歸分析，結果顯示，HPV陽性(HR=0.32，95% CI 0.18-0.58，P<0.001)、吸煙(HR=2.50，95% CI 1.27-4.91，P=0.008)、存在合并癥(HR=2.08，95% CI 1.07-4.01，P=0.032)及分化程度高(HR=0.26，95% CI 0.13-0.55，P<0.001)為口咽癌總生存率獨立預后因素，疾病特異生存率結果類似，但存在合并癥不再具有統計學意義(見表2)。

表1 100例口咽癌患者的臨床資料

縮寫：HPV，人乳頭狀瘤病毒a手術治療，包括手術，手術+放療，手術+放化療；b非手術治療，包括放療和化療

表2 口咽癌相關預后因素單因素與多因素分析

縮寫： HPV,人乳頭狀瘤病毒;CI,可信區間;HR,風險比;OS,總生存率;DSS,疾病特異性生存率

HPV陽性口咽癌組織中PD-L1陽性率為70%(35/50)，顯著高于HPV陰性口咽癌患者的42%(21/50)(P=0.005)。PD-L1陽性表達者多見于年輕患者(P=0.020)，而與其他臨床病理特征包括性別、吸煙、飲酒、腫瘤原發部位、腫瘤分期及分化程度無明顯相關性。PD-L1陽性為改善口咽癌患者總生存率和疾病特異性生存率的獨立預后因素(DSS,P<0.001;OS,P<0.001)(見圖1A)。

為進一步分析HPV陽性口咽癌患者與HPV陰性患者中PD-L1表達的相關預后差異，我們將其進行分組。結果提示，HPV+/PD-L1+患者較 HPV+/PD-L1-者(DSS,P<0.001;OS,P=0.004)，HPV-/PD-L1+者(DSS,P=0.010;OS,P=0.047) 以及HPV-/PD-L1-者(DSS,P<0.001;OS,P<0.001)具有顯著的預后優勢(見圖1B)。

圖1 口咽癌患者A) PD-L1；B) HPV/PD-L1 總生存率的Kaplan-Meier曲線

3 討論

HPV感染為口咽癌的重要致病因素之一，全球約31%的口咽癌由HPV感染導致[7]。HPV陽性口咽癌較HPV陰性口咽癌通常分期較晚，分化較差[8,9]。2010年新英格蘭醫學雜志上報道了RTOG0129臨床試驗的部分研究結果，發現HPV陽性口咽癌患者預后明顯較HPV陰性口咽癌患者預后要好，3年生存率分別為62.4%(95% CI,77.2-87.6)和57.1% (95% CI,48.1-66.1)[4]。此后，越來越多的研究提示HPV陽性口咽癌患者預后明顯改善。本研究通過傾向性評分匹配，納入50對HPV陽性及HPV陰性口咽癌患者，進一步證實了在中國人群中，HPV陽性為口咽癌良好預后的獨立因素(HR=0.32，95% CI 0.18-0.58，P<0.001)。

然而，HPV陽性口咽癌預后較好的機制尚不明確。部分學者將 HPV 陽性腫瘤預后較好歸因于對放化療的敏感性增強[10,11]。然而，單純手術的 HPV陽性腫瘤患者較分期相當的HPV陰性患者的預后仍有所改善[12]。Williams等發現表達E6/E7蛋白的HPV陽性腫瘤細胞在免疫活性小鼠中的增殖速度顯著落后于 HPV 陰性腫瘤，但同樣的實驗結果在免疫缺失的裸鼠體內卻未被發現，據此推測 HPV 陽性腫瘤較好的臨床預后可能與機體的適應性免疫相關[13]。免疫治療，尤其是針對PD-1/PD-L1的免疫檢查點抑制劑在多種腫瘤(例如肺癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌、結腸癌等)治療中展現出良好前景，在頭頸部鱗癌中亦取得了不錯的療效。需要注意的是，僅小部分患者表現出持久療效。Checkmate 141[14]等臨床研究發現頭頸癌PD-L1陽性者接受PD-1抑制劑nivolumab治療后療效更好。因此有必要進行針對我國人群口咽癌患者進行PD-L1表達水平的檢測，以為HPV陽性患者更好的臨床預后提供理論基礎，同時為PD-1/PD-L1應用于頭頸腫瘤提供基線數據。

口咽癌PD-L1的表達與HPV感染的相關性尚不明確。部分研究報道PD-L1的表達與HPV感染無明顯相關性[15,16]，而另外一些研究發現PD-L1在HPV陽性頭頸腫瘤中表達率更高[17]。本研究發現口咽癌PD-L1的表達與HPV感染狀態存在顯著性相關。HPV陽性口咽癌組織中PD-L1陽性率(70%)顯著高于HPV陰性口咽癌患者的42%(P=0.005)。這些矛盾結果可能部分歸因于分析方法缺乏統一性，包括觀察者之間的免疫組織學檢測的變異性、缺乏確定PD-L1表達情況的標準化抗體以及定義陽性表達的各種臨界值不同。同時，腫瘤細胞中PD-L1的表達在疾病的不同階段可能發生動態變化，檢測結果可能受活檢時間的影響。而且腫瘤具有異質性，同一病灶的不同位置，不同病灶之間PD-L1的表達可能是不同的。

PD-L1作為免疫檢查點配體，與細胞毒性T細胞上的PD-1結合后可造成其功能耗竭，從而協助腫瘤細胞逃避免疫監視。既往研究發現，在多種腫瘤中PD-L1的過表達與遠處轉移及不良預后相關，其中包括腎癌、皮膚癌、肺癌和胰腺癌等[18-26]。在頭頸腫瘤中，PD-L1過表達與頭頸腫瘤的預后關系尚無一致性結果[17,27-29]。本研究結果提示，PD-L1陽性為改善總生存率和疾病特異性生存率的獨立預后因素(DSS,P<0.001;OS,P<0.001)。同時，HPV+/PD-L1+患者較 HPV+/PD-L1-者(DSS,P<0.001;OS,P=0.004)，HPV-/PD-L1+者(DSS,P=0.010;OS,P=0.047) 以及HPV-/PD-L1-者(DSS,P<0.001;OS,P<0.001)具有顯著的預后優勢。這種矛盾和不一致性可能與以下原因有關：(1)病毒相關腫瘤由病毒相關癌蛋白致癌，通常腫瘤突變負荷呈低度或中度。病毒感染后出現相關新抗原，可能引起更強的免疫反應，多種病毒相關腫瘤表現為較強的免疫應答及PD-L1過表達[30,31]；(2)腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原激活免疫系統后，腫瘤細胞PD-L1表達上調，PD-L1表達可能代表先前的內源性抗腫瘤免疫反應，該反應減速但未能完全阻止腫瘤生長，可以使用PD-1/PD-L1抑制劑使之恢復活力[32]；(3)有研究提示PD-L1過表達機制不同，包括動態IFNγ或癌基因激活[33,34]，前者IFNγ升高導致的PD-L1過表達為獲得性免疫的一部分，通常與免疫細胞浸潤相關，表現為局限性過表達[35]；癌基因激活相關的PD-L1過表達通常缺少淋巴細胞浸潤而呈彌漫性過表達[34,36]。不同機制導致的PD-L1過表達可能與免疫檢查點抑制劑療效不同相關。

總之，本研究結果證實HPV陽性口咽癌較HPV陰性口咽癌患者預后明顯改善。PD-L1在HPV陽性口咽癌患者表達程度更高，為口咽癌的良好獨立預后因素，HPV陽性口咽癌患者較好的預后可能與不同的免疫微環境有關。