sPD-L1在肺癌患者血清及胸膜腔積液中水平差異及相關性分析

趙 爽,熊 芳

(重慶三峽中心醫院 1.健康管理中心；2.重癥醫學科，重慶404000)

非小細胞肺癌(NSCLC)是常見的惡性肺部腫瘤病變,其主要病理類型類為腺癌和鱗癌,由于缺乏有效的早期檢查手段,確診時78%-80%患者已屬晚期,臨床晚期NSCLC患者約80%伴有惡性胸膜腔積液[1]。目前,針對程序性細胞死亡配體1(programmed cell death legend1,PD-L1)/程序性細胞死亡受體1(programmed cell death-1,PD-1)的治療已成為肺癌治療的重要研究方向[2,3]。PD-1/PD-L1通路是機體免疫檢查點之一,其生理作用是維持機體的免疫耐受和避免過度的免疫反應對正常組織造成損害。然而腫瘤細胞可利用PD-1/ PD-L1通路產生抑制性的腫瘤微環境獲得免疫逃逸[4]。腫瘤細胞產生的PD-L1包括膜表達型(mPD-L1)和可溶型(sPD-L1)。mPD-L1常在細胞和組織中被檢測到,而sPD-L1則可通過病人的外周血液和體腔積液被檢測。已有研究顯示肺癌病人外周血液中的sPD-L1和胸腔積液中的sPD-L1水平均升高,且對患者預后和對免疫治療的反應性具有指示作用[5,6]。但不同病理類型的肺癌發病的機制和腫瘤細胞生物學行為不同,提示患者體內sPD-L1分布可能不同,為了進一步確證不同病理類型肺癌患者體內的sPD-L1表達特征,以便后續研究更準確的探索其臨床價值,我們在分析了64例伴隨胸腔積液的肺癌患者的臨床資料的基礎上,分別檢測患者外周血液和胸腔積液中sPD-L1水平,并進行相關性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象 收集2016年12月至2018年5月在我院重癥醫學科收治的64例肺癌病人的血液標本和胸膜腔積液標本,所有患者均經病理學檢查明確診斷為NSCLC(肺腺癌或鱗癌),所有患者均有詳細的病歷資料,包括：性別、年齡、吸煙情況、腫瘤大小、TNM分期、遠處轉移情況、病理類型等。入選患者中男性47例,女性17例,年齡35-83歲,肺腺癌38例、肺鱗癌26例,根據第八版肺癌TNM分期Ⅰ期3例, Ⅱ期7例,Ⅲ期20例,Ⅳ期34例。本研究經我院倫理委員會同意并得到批準,所有入組患者均簽署知情同意書。

1.1.2研究主要試劑和設備 人細胞程序性死亡蛋白1配體1(PDCD1LG1)ELISA檢測試劑盒：USCN000518,美國；酶標儀：Bio-Rad美國。

1.2 方法

1.2.1標本采集 采集病人外周血3 ml并置于抗凝管中,1 000×g 離心10 min后取上層液體分裝后置于-80℃冰箱中冷凍保存。行胸腔穿刺術抽取病人胸腔積液30 ml,在低溫離心機中以1 000×g離心10 min后收集上清并分裝保存于-80 ℃冰箱內,用于測定sPD-L1水平。

1.2.2sPD-L1的檢測 采用ELISA法檢測外周血和胸腔積液sPD-L1水平,操作步驟根據“人細胞程序性死亡蛋白1配體1(PDCD1LG1)ELISA檢測試劑盒”說明書進行,簡要步驟如下：首先吸去酶標板內的液體；清洗液洗滌3次后分別加入樣品或標準品100 μl,1孔只加稀釋液作為對照；37℃反應90 min后用棄去酶標板內的液體；清洗液洗滌2次后加入生物素化人ANG抗體工作液各100 μl,37℃反應60 min；清洗液清洗3次后各加入100 μl ABC工作液,37℃反應30 min；清洗液洗滌5次,加入顯色液輕微震蕩混勻,避光孵育20 min,每孔加入100 μl終止液終止反應,并在30 min之內使用酶標儀在450 nm波長下測量各孔的吸光度值,根據吸光度值計算外周血和胸腔積液sPD-L1的水平。

2 結果

2.1 外周血及胸腔積液sPD-L1水平與臨床病理因素的關系

病人年齡多數大于60歲( 68.8%),且多為男性(73.4%),約77%的患者有吸煙史；腫瘤病灶最長徑之和大于7 cm者38例,占59.4%；根據第七版肺癌TNM分期,Ⅰ/Ⅱ期共10例,Ⅲ/Ⅳ期共54例；48例患者確診時已發生淋巴結轉移。進一步分析sPD-L1水平與臨床病理因素間關系發現,患者年齡、性別、吸煙狀況與sPD-L1水平均無關系(P>0.05),而在腫瘤大小、TNM分期、是否有淋巴結轉移間差異有統計學意義(P<0.01),腫瘤>7 cm者胸膜腔積液內sPD-L1水平較腫瘤≤7 cm者高,Ⅲ/Ⅳ期及有淋巴結轉移的患者胸腔積液和外周血中sPD-L1水平均較高。 見表1。

2.2 肺腺癌、肺鱗癌患者外周血和胸腔積液中sPD-L1水平的比較

肺腺癌中外周血sPD-L1水平為(1.71±0.13)ng/mL,胸腔積液中sPD-L1水平為 (1.26±0.11)ng/mL；肺鱗癌中外周血sPD-L1水平為(1.86±0.30)ng/mL,胸腔積液中sPD-L1水平為(0.89±0.14)ng/mL。無論肺腺癌或肺鱗癌,外周血中sPD-L1均高于胸腔積液中sPD-L1水平(P<0.05)。見表2。

2.3 患者外周血和胸腔積液中sPD-L1水平的相關性分析

分析患者外周血和胸膜腔積液中sPD-L1水平的相關性,發現肺腺癌患者外周血和胸腔積液中sPD-L1水平存在相關性(P<0.01,r=0.63),而肺鱗癌患者外周血sPD-L1水平和胸腔積液中sPD-L1水平不相關(P>0.05,r=0.12)。見圖1。

表1 肺癌患者外周血和胸腔積液sPD-L1水平與臨床病理因素的關系

表2 64例肺癌患者外周血和胸腔積液中sPD-L1水平

圖1 肺腺癌和肺鱗癌患者外周血sPD-L1水平和胸腔積液中sPD-L1水平的相關性

3 討論

阻斷PD-1/PD-L1通路使肺癌的治療邁入了一個新的臺階。多項試驗表明,免疫檢查點抑制劑在PD-L1高表達的肺癌患者中療效更顯著[7]。但目前對患者體內PD-L1表達水平仍缺乏準確統一的檢測和分析方法,臨床上使用的仍為傳統的免疫組織化學法,但現有研究表明同一患者在不同的抗體、不同的檢測平臺、不同的判讀標準下所檢測出的PD-L1表達水平存在差異[8],故而探尋更為科學有效的PD-L1表達情況檢測方法是目前臨床肺癌治療及檢驗學科亟需解決的命題。機體免疫系統中PD-L1分別以細胞膜型和可溶性分子兩種形式存在,且sPD-L1的含量與mPD-L1的表達強度相關,二者具有相似的生物學功能,均能在抗腫瘤免疫中起負調控作用[9]。提示sPD-L1可能作為肺癌診斷、治療監測及判斷預后的一個良好指標,且sPD-L1可在體液中被檢測,取材方便,因此,深入研究sPD-L1在腫瘤患者體內的表達情況有望成為提高PD-L1檢測水平、方便PD-1/PD-L1高表達患者的治療監測及判斷預后的有效方法,最終服務于腫瘤患者接受更精準的治療。

本研究在不同病理類型肺癌中分析患者血清及胸膜腔積液中sPD-L1的表達水平及差異,結果顯示雖然肺腺癌及肺鱗癌外周血中sPD-L1均高于胸腔積液中sPD-L1水平,但肺鱗癌患者外周血內sPD-L1水平高于肺腺癌患者,而胸膜腔積液內sPD-L1水平卻是肺腺癌患者高于肺鱗癌,說明不同病理類型的NSCLC患者體液內sPD-L1的分布存在差異。提示不同病理類型的腫瘤檢測sPD-L1的標本來源或參考基線值應該不同。分別對肺腺癌和肺鱗癌患者外周血和胸腔積液中sPD-L1水平行相關性分析,結果顯示僅肺腺癌患者外周血和胸腔積液中sPD-L1含量存在相關性,提示肺腺癌患者的胸膜腔積液中sPD-L1水平對患者腫瘤組織中PD-1/PD-L1表達具有更重要的提示作用。目前,已經有研究者發現腫瘤患者的血液循環內的sPD-L1來自腫瘤細胞分泌的外泌體[10],故而不同病理類型患者體內sPD-L1水平分布不同可能與腫瘤細胞自身的生物學功能相關,其中更深層次的原因還有待進一步研究。

總而言之,目前因缺乏統一有效的檢測和分析方法,加大了國內外學者研究sPD-L1在腫瘤發生發展過程中的作用的難度。但其作為一個重要的PD-1/PD-L1通路相關分子,有必要對其進行深入研究。作為阻斷PD-1/PD-L1通路治療的重要受益者,肺癌患者尤其是不同病理類型的肺癌患者體內sPD-L1表達特征及水平差異,或提示不同病理類型的腫瘤患者其PD-1/PD-L1表達水平的檢測方法或可不同。