腦膠質瘤組織中細胞周期蛋白B2的表達變化及其與患者臨床病理特征、預后的關系

趙亞運，張墨軒，潘景臻，司茂飛，趙志明，張健

1山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)，山東泰安271000；2臨沂市人民醫院；3濰坊醫學院

腦膠質瘤是起源于神經膠質細胞的常見原發性腦腫瘤，占大腦和中樞神經系統惡性腫瘤的30%，并且以多形性膠質母細胞瘤(GBM)為主，患者的中位生存期不到15個月[1,2]。近年來研究發現，O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)啟動子甲基化、IDH基因變異、染色體1p/19q共缺失、TERT啟動子變異等均有助于腦膠質瘤的臨床診斷、預后及化療敏感性判斷，但其敏感度和準確度有限[3,4]。細胞周期蛋白B2(CCNB2)屬于B型細胞周期家族蛋白，位于染色體15q22.2，與細胞周期依賴型激酶(CDKS)結合調節CDKS活性，不同的細胞周期蛋白在細胞周期的特定階段具有時空特性[5]。CCNB2通過激活細胞分裂周期蛋白激酶2(CDK2)，參與真核細胞周期中的G2/M期轉化。研究表明，CCNB2過表達與結直腸癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發生、發展有關[6～8]，但其在腦膠質瘤組織中的表達變化及其與患者臨床病理特征、預后的關系尚不清楚。為此，我們進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年6月～2014年6月于臨沂市人民醫院神經外科首次接受手術治療的腦膠質瘤患者65例作為觀察組，男32例、女33例，年齡4～70歲、中位年齡44歲；腫瘤部位：額葉40例，顳葉16例，其他9例；KPS評分：<80分34例，≥80分31例；WHO分級：Ⅰ～Ⅱ級31例，Ⅲ～Ⅳ級34例；腫瘤直徑：<4 cm 21例，≥4 cm 44例；p53基因型：野生型38例，突變型27例；Ki-67表達：陽性27例，陰性38例。患者均經術后病理證實；排除術前行放療、化療及免疫治療者，合并心、肝、腎等功能不全者，合并其他腫瘤者，腫瘤直徑太小無法獲取標本者。選擇同期因顱腦外傷行顱內減壓手術的患者30例作為對照組，男15例、女15例，年齡5～70歲、中位年齡44歲。兩組性別、年齡均具有可比性。本研究通過醫院倫理委員會審核，患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 腦組織CCNB2檢測方法 采用免疫組化法。觀察組術中收集腦膠質瘤組織，對照組術中收集切除的腦組織。將兩組腦組織進行石蠟包埋，4 μm厚度切片，70 ℃烤箱中烘烤1 h，二甲苯脫蠟，順濃度梯度乙醇水化。將脫蠟水化后的切片置于10 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH值為6.0)中，微波加熱進行抗原修復，自然冷卻至室溫。滴加阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育10 min，PBS緩沖液沖洗2 min×3次；滴加CCNB2抗體(1∶100)，37 ℃條件下孵育3 h，PBS緩沖液沖洗2 min×3次。滴加反應增強液，室溫孵育20 min，PBS緩沖液沖洗2 min×3次。滴加抗鼠/兔IgG二抗，室溫下孵育20 min，PBS緩沖液沖洗2 min×3次。加入適量新鮮配制的二氨基苯胺(DAB)，室溫暗箱孵育3～5 min，加水終止顯色。流動水沖洗，蘇木素、鹽酸乙醇分化液和氨水返蘭復染，脫水、透明、封片后顯微鏡觀察。免疫組學分析和評分均由2名病理科醫師獨立完成，以細胞質和(或)細胞核中出現棕黃色顆粒定義為陽性染色，根據染色強度(0～3級)和陽性細胞比例(0～100%)進行評分。評分標準：染色強度0級評分為0分，染色強度2級、陽性細胞比例<10%評分為2分，染色強度1級、陽性細胞比例>50%評分為3分，染色強度2級、陽性細胞比例10%～50%評分為4分，染色強度2級、陽性細胞比例>50%評分為5分，染色強度3級、陽性細胞比例100%評分為6分。評分>4分定義為CCNB2陽性表達。

1.3 隨訪方法 觀察組術后隨訪記錄生存時間，生存時間定義為從診斷之日起至腦膠質瘤相關死亡的時間間隔。

1.4 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗或秩和檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制觀察組腦膠質瘤組織CCNB2表達陽性與陰性患者的生存曲線，生存時間比較采用Log-Rank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組腦組織CCNB2陽性表達率比較 觀察組腦膠質瘤組織CCNB2陽性表達率為50.8%(33/65)，對照組腦組織CCNB2陽性表達率為16.7%(5/30)，兩組比較P<0.01。

2.2 觀察組腦膠質瘤組織CCNB2表達與患者臨床病理特征的關系 觀察組腦膠質瘤組織CCNB2陽性表達與患者WHO分級、p53基因型、Ki-67表達均有關(P均<0.05)。觀察組腦膠質瘤組織CCNB2陽性表達與患者性別、年齡、腫瘤位置、KPS評分、腫瘤直徑均無關(P均>0.05)。見表1。

2.3 觀察組腦膠質瘤組織CCNB2表達與患者預后的關系 觀察組腦膠質瘤組織CCNB2陽性表達患者生存時間為(44.0±5.7)月，陰性表達患者為(81.0±6.4)月，兩者比較P<0.01。

3 討論

腦膠質瘤的發病原因很多，腦內遺傳因素和殘留的胚胎原始細胞是導致腦膠質瘤發生的重要內源性影響因素，有害的理化因素以及病毒感染則是外源性因素。目前腦膠質瘤的發病機制尚不清楚，Rb、p53和受體酪氨酸激酶(RTK)信號通路等在腦膠質瘤尤其在GBM的發生過程中具有重要作用[9]，調控這些通路的基因和蛋白不僅可以作為腦膠質瘤的治療靶點和診斷標志物，還可以用來評估腦膠質瘤的病理特征。B型細胞周期蛋白家族包括CCNB1和CCNB2。在分裂間期，CCNB1持續在細胞核和細胞質間穿梭；在分裂間期末，CCNB1快速進入細胞核，并與有絲分裂體結合；與之相反，在分裂間期和有絲分裂期，CCNB2會穿出細胞核，逐漸靠近高爾基體。盡管CCNB1和CCNB2在細胞內的定位不同，但是兩者共同發揮促使細胞進入G2/M期的重要功能。CCNB2與CDK2相互作用，形成絲氨酸/蘇氨酸激酶合酶復合物，稱為成熟促進因子(MPF)。CCNB2在G1期合成，一般通過激活CDK2激酶觸發G2/M轉化，然后在前中期和后期表達迅速下降，抑制CCNB2表達可以誘導細胞周期停滯[10]。在正常情況下，CCNB2表達受到嚴格調控，但在一些惡性細胞中CCNB2降解受到抑制，導致CCNB2過表達，CCNB2的異常表達可導致G2/M期調節點修復受損DNA和維持基因組完整的功能失常，由此導致基因突變和腫瘤發生[10]。

表1 觀察組腦膠質瘤組織CCNB2表達與患者臨床病理特征的關系

研究表明，CCNB2在胃癌、上皮性卵巢癌和彌漫性大B細胞淋巴瘤組織中表達上調[11～13]。與正常對照組相比，肺癌和消化道腫瘤患者血清CCNB2 mRNA表達升高，并與癌癥分期和轉移狀態有關[14]。有研究基于KEGG、PPI網絡和WGCNA分析中的重復基因，篩選出CCNB2可作為腦膠質瘤的候選診斷標記基因[15]。研究表明，在腦膠質瘤組織和星形膠質細胞瘤組織中CCNB2 mRNA和蛋白表達均升高[16]。本研究顯示，觀察組腦膠質瘤組織中CCNB2陽性表達率明顯高于對照組，表明CCNB2表達升高可能參與了腦膠質瘤的發生。Ki-67是一種存在于增殖細胞的核抗原，表達于細胞周期的G1/M期，在G0期表達受到抑制，是細胞進入增殖周期的標志物。 Ki-67是應用最廣泛的細胞增殖標志物之一，Ki-67陽性率越高表明處于增殖周期的細胞越多，腫瘤生長越快，組織分化越差。p53可分為野生型和突變型，野生型p53是一種快速誘導受損細胞凋亡的抑癌基因，可防止具有潛在癌變潛能的細胞發生癌變，發揮抗癌作用。野生型p53一旦發生突變，就不再具有抑瘤作用，反而會加速癌細胞的增殖和生長。當野生型p53轉化為突變型p53時，突變型p53作為原癌基因在腫瘤細胞中長期存在，最終導致腫瘤發生。本研究結果顯示，觀察組腦膠質瘤組織CCNB2陽性表達與患者WHO分級、p53基因型、Ki-67表達均有關，與患者性別、年齡、腫瘤位置、KPS評分、腫瘤直徑均無關，且CCNB2陽性表達與腫瘤增殖指標Ki-67及突變型p53表達有關，提示CCNB2在腦膠質瘤的發展過程中發揮促瘤作用。

Shubbar等[8]研究表明，CCNB2蛋白過表達與乳腺癌患者的短期疾病特異性生存(DSS)密切相關，是乳腺癌患者DSS的獨立預測指標。Takashima等[17]研究表明，CCNB2 mRNA高表達的肺腺癌患者總體生存率低于CCNB2 mRNA低表達者。還有研究表明，CCNB2過表達提示非小細胞肺癌患者預后不良[7]。本研究結果顯示，觀察組腦膠質瘤組織CCNB2陽性表達患者生存時間明顯短于陰性表達患者，說明腦膠質瘤組織CCNB2表達升高提示患者生存時間短、預后較差。

綜上所述，腦膠質瘤組織中CCNB2蛋白表達升高，CCNB2蛋白表達升高可能參與了腦膠質瘤的發生與發展，并提示患者預后不良。