七氟醚對新生大鼠前額葉皮層和海馬組織NR1、NR2A、NR2B表達及行為學的影響

張虓宇，賈麗潔，徐子鋒

上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院上海市胚胎源性疾病重點實驗室，上海200030

NMDA受體是由NR1、NR2(A～D)、NR3亞型組成的受體復合物，不僅參與學習記憶的形成和各種神經心理疾病的發生發展，而且對神經系統發育至關重要[1]。七氟醚是小兒和產科手術廣泛使用的全身吸入麻醉藥物，可能對神經系統發育帶來不良影響，但機制尚不明確[2]。七氟醚對中樞神經系統的麻醉和鎮痛作用部分是通過NMDA受體而發揮作用。既往研究表明，NMDA受體可能參與了全身麻醉藥物對發育大腦的神經毒性作用[3]，但其參與七氟醚神經發育毒性的機制尚不明確。2018年6月～2019年10月，本研究觀察了七氟醚對新生大鼠發育過程中前額葉皮層和海馬組織NR1、NR2A、NR2B表達的影響以及相關行為學改變。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：新生6日齡雄性SD大鼠54只，體質量8～10 g，購于上海斯萊克實驗動物公司。主要試劑：HRP標記的抗兔二抗、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購于上海碧云天生物技術有限公司，抗NR1抗體、抗NR2A抗體、抗NR2B抗體均購于美國Abcam公司。主要軟件及儀器：Anymaze視頻分析軟件購于美國Stoelting公司，Truscan系統軟件及自發活動觀察箱均購于美國Coulbourn公司。

1.2 動物分組與處理 將54只新生6日齡SD大鼠隨機分為七氟醚組和對照組，每組27只。第6、7、8日齡時，七氟醚組每日吸入2.1%七氟醚2 h，對照組每日吸入70% O22 h，吸入過程中使用加溫墊保證新生大鼠中心體溫不低于37 ℃。

1.3 大鼠缺氧情況觀察 兩組8日齡時分組處理0、2 h，分別隨機選取3只大鼠，麻醉狀態下抽取心臟動脈血0.3 mL。采用雅培i-STAT300G血氣分析儀進行血氣分析，記錄pH、動脈血氧分壓(PaO2)、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)。

1.4 大鼠前額葉皮層與海馬組織NR1、NR2A、NR2B表達檢測 采用Western blotting法。兩組8日齡時分組處理完成即刻及21日齡時，分別隨機選取7只大鼠，水合氯醛麻醉后斷頭處死，分離前額葉皮層和海馬組織。提取膜蛋白，根據BCA蛋白定量結果調整上樣體積。制備8%分離膠與5%分離膠，濃縮膠以80 V電壓進行電泳，分離膠以120 V電壓進行電泳，總時間約為1.5 h。將凝膠轉移到0.45 μm PVDF膜上，恒流200 mA進行轉膜(NR1轉膜120 min，NR2A、NR2B轉膜180 min，內參Tubulin轉膜45 min)。轉膜結束后用含5%脫脂牛奶的TBST在室溫下封閉1 h，TBST漂洗，分別加入NR1、NR2A、NR2B以及Tubulin一抗(稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。取出PVDF膜，TBST洗脫3次，每次5 min，加入二抗(稀釋比例均為1∶1 000)，室溫下孵育60 min。ECL顯色，凝膠成像儀進行曝光、拍照，Quantity One軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白與Tubulin條帶灰度值的比值計算目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.5 大鼠行為學觀察

1.5.1 自發活動觀察 兩組剩余大鼠(每組7只)分別于21、28、35日齡時進行曠場實驗。將大鼠放入Truscan系統自發活動觀察箱(50 cm×50 cm×45 cm)的中心位置，允許其自由活動。采用Truscan系統軟件記錄兩組自發運動次數、刻板樣運動次數、運動時間、運動距離，觀察時間為1 h。實驗重復3次，取平均值。

1.5.2 注意力觀察 兩組35日齡時曠場實驗完成后進行Y迷宮自發性交替反應實驗。將大鼠放入Y迷宮中心，自由探索8 min，實驗操作人員脫離大鼠的視線范圍。Y迷宮的三個臂隨機設為1、2、3，采用Anymaze視頻分析軟件自動記錄小鼠進入每個臂的順序號，統計進入各個臂的總次數(簡稱為總探索次數)，并計算自發交替行為正確率。自發交替行為正確率=總交替數/(總交替數-2)×100%，總交替數為含有連續三個臂序號的三聯串總次數。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 兩組pH、PaO2、PaCO2比較 兩組8日齡分組處理0、2 h時pH、PaO2、PaCO2比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 兩組不同時間點pH、PaO2、PaCO2比較

2.2 兩組8、21日齡時前額葉皮層與海馬組織NR1、NR2A、NR2B蛋白表達比較 見表2。

表2 兩組8、21日齡時前額葉皮層與海馬組織NR1、NR2A、NR2B蛋白表達比較

注：與同組8日齡時比較，*P<0.05；與對照組同時間點比較，#P<0.05。

2.3 兩組自發活動相關指標比較 隨著日齡的增加，兩組自發運動次數、刻板樣運動次數、運動時間、運動距離均逐漸增加，七氟醚組上述指標均高于同日齡對照組(P均<0.05)。見表3。

表3 兩組不同時間點自發活動相關指標比較

注：與同組21日齡時比較，*P<0.05；與同組28日齡時比較，#P<0.05；與對照組同時間點比較，△P<0.05。

2.4 兩組注意力相關指標比較 七氟醚組與對照組總探索次數分別為(22.67±1.57)、(22.17±1.35)次，兩組比較P>0.05；七氟醚組與對照組自發交替行為正確率分別為0.62%±0.02%、0.75%±0.01%，兩組比較P<0.05。

3 討論

反復多次手術麻醉與神經退行性改變以及隨后出現的神經行為異常關系密切。多項回顧性研究發現，麻醉對于兒童學習記憶能力的影響會隨著麻醉次數的增加而逐漸加重，單次麻醉并不會對神經系統造成顯著不良后果[4,5]。這表明在腦發育高峰時期，反復多次的手術麻醉可能造成神經發育的退行性改變以及認知行為異常。七氟醚麻醉會對新生大鼠呼吸功能和循環功能產生影響，而缺氧被認為是造成神經退行性改變的原因之一。為了維持實驗動物的呼吸和循環狀態，并排除缺氧對實驗數據的影響，本研究對兩組大鼠進行血氣分析。結果顯示，兩組pH、PaO2、PaCO2比較差異均無統計學意義，說明本研究中七氟醚麻醉并沒有影響新生大鼠的呼吸及循環功能，并排除了缺氧對實驗數據的影響。

阻斷NMDA受體可以影響突觸可塑性，減少NMDA受體的信號傳導[6]。在神經發育期間，七氟醚麻醉可以抑制NMDA受體活性，導致NMDA受體功能降低。本研究結果顯示，新生大鼠經七氟醚處理后(8日齡)即存在前額葉皮層部位NR1和NR2B蛋白表達升高，但對NR2A沒有顯著作用，而七氟醚對于兩組8、21日齡時的海馬組織NR1、NR2A和NR2B蛋白表達沒有顯著影響；這表明8日齡大鼠前額葉皮層部位NR1和NR2B對于七氟醚麻醉的作用較為敏感。既往研究中，其他一些NMDA受體拮抗劑處理后同樣可以引起NR1、NR2B表達升高，包括乙醇、苯環己哌啶和氯胺酮[7,8]。導致這一改變的機制并不明確，可能的原因是NMDA受體拮抗劑處理后機體NMDA受體表達代償性增加，以彌補NMDA受體拮抗所造成的功能下降。由于NMDA受體過度表達與神經興奮性毒性有關，因此NR1和NR2B表達升高可能會進一步加重全麻藥物對神經發育期大腦的毒性作用。

在發育不同階段，神經系統NMDA受體亞型組成對于中樞神經系統的成熟至關重要，且NMDA受體復合物的亞型組成會隨神經系統發育而變化[9]。NR1在人體出生即有表達，出生后2～3周表達量達到高峰，此后逐漸下降至成年水平；NR2B在胚胎期即有表達，在出生時表達量較多，2周后逐漸下降；NR2A在人體出生時表達量較低，隨著發育而表達量逐漸升高，出生3周時可代替NR2B成為主要的NR2亞型。因此，NR2A/NR2B隨著發育過程而逐漸升高[10]。NR2B向NR2A的轉變標志著神經系統逐漸成熟以及認知功能的完善，NMDA受體亞型組成異常可能損害正常的神經環路結構形成以及神經細胞遷移，并對生物體正常行為造成不利影響[11]。因此，反復多次七氟醚麻醉所引起的年齡依賴性NMDA受體組成改變，可能對大腦認知功能的完善造成不良影響，并可能會引起大腦皮層結構和功能的永久性損害。本研究結果顯示，8日齡時七氟醚組前額葉皮層組織NR1、NR2B蛋白表達升高，NR2A蛋白表達無顯著變化，但21日齡時七氟醚組前額葉皮層組織NR1、NR2B蛋白表達升高，NR2A蛋白表達明顯降低，NR2A/NR2B未出現應有的比例升高，而是出現了比例下降；這表明反復七氟醚麻醉可以導致新生大鼠發育過程中前額葉皮層NMDA受體亞型組成轉變的延遲。

前額葉皮層與工作記憶、自我調節和目標導向性行為有關，并且在整個生命活動過程中對神經結構和功能的可塑性具有重要作用[12]。自發活動增加與工作記憶注意力下降是注意力缺陷多動癥(ADHD)的兩個主要特征[13]。研究表明，前額葉皮層對于調節許多與ADHD相關的神經功能具有密切聯系，不僅包括行為抑制、注意力和工作記憶，也涵蓋了覺醒狀態維持和情緒調節[14]。臨床隊列研究表明，2歲以前需要多次接受全身麻醉的患兒在日后發育過程中發生ADHD的風險顯著增加[15]。本研究行為學檢測發現，兩組自發運動次數、刻板樣運動次數、運動時間、運動距離均隨著日齡的增加而逐漸增加，七氟醚組上述指標均高于同日齡對照組，表明新生大鼠接受反復七氟醚麻醉可能導致發育過程中自發活動增多；七氟醚組自發交替行為正確率明顯低于對照組，表明七氟醚處理后大鼠注意力下降。分析原因，可能與多次七氟醚處理所引起的大鼠前額葉皮層NR2B向NR2A轉變的延遲有關。

綜上所述，反復七氟醚麻醉對新生大鼠海馬組織NR1、NR2A、NR2B蛋白表達沒有顯著影響，但會導致新生大鼠發育過程中前額葉皮層NMDA受體亞型組成轉變的延遲，并引起大鼠自發活動增加、注意力下降。