山慈菇提取物對肝癌細胞Huh7增殖、凋亡的影響及其機制

方健，王辰男，孟慶剛

北京中醫藥大學，北京100029

肝癌是臨床常見惡性腫瘤之一，大部分患者確診時已處于中晚期，臨床主要采用放療、化療等方法治療中晚期肝癌患者，但效果不佳、患者預后較差[1,2]。研究顯示，中醫藥成分具有抗腫瘤作用[3]。山慈菇屬于蘭科植物的干燥根莖，具有抗腫瘤作用，山慈菇提取物(CAE)可通過調控細胞生物學行為而發揮抗腫瘤作用[4,5]，但CAE對肝癌細胞增殖及凋亡的影響鮮見報道。研究顯示，微小RNA-329(miR-329)在肝癌細胞中呈低表達，并可參與肝癌的發生及發展過程，而miR-329-3p是從miR-329前體的3′端臂加工而來[6]。含跨膜Bax抑制劑的母體6(TMBIM6)在多種腫瘤中表達上調，并可能參與腫瘤發生及發展過程[7]。生物信息學分析顯示，TMBIM6可能是miR-329-3p的靶基因，但目前關于miR-329-3p與TMBIM6在肝癌細胞中的表達及其調控機制尚未可知。2017年3月～2018年2月，本研究觀察了CAE對肝癌細胞增殖及凋亡的影響，并分析其對miR-329-3p/TMBIM6的調控作用，為揭示CAE的抗腫瘤機制奠定理論基礎。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人肝癌細胞株Huh7購自美國ATCC公司， 將其置于含有10%胎牛血清與青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM完全培養基中，37 ℃恒溫培養箱進行傳代培養。主要藥物及試劑：山慈菇購自華寶針藥有限公司；DMEM培養基、胎牛血清與胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher公司，Lipofectamine 2000、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。甲基噻唑基四唑(MTT)購自北京富龍康泰生物技術有限公司，膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒購自美國Sigma公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。兔抗人TMBIM6抗體購自上海甄準生物科技有限公司，兔抗人細胞周期蛋白1(Cyclin D1)、p21抗體購自美國CST公司，兔抗人B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bax)抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。主要質粒：miR-329-3p寡核苷酸模擬物(miR-329-3p mimics)及其陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-329-3p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-329-3p)及其陰性對照(anti-miR-NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 CAE制備 精確稱量50 g山慈菇粉末，依次加入500、400、300 mL去離子水中，加熱、冷卻、過濾；加入95%乙醇洗滌，得到山慈菇干粉6 g，參照相關文獻配置濃度為10、20、30 mg/mL的CAE[8]。

1.3 CAE對Huh7細胞增殖、凋亡及miR-329-3p、TMBIM6表達的影響觀察

1.3.1 細胞分組與處理 取對數期Huh7細胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養基制備細胞懸液，調整細胞密度為3×104/mL，按照100 μL/孔接種于96孔板。將細胞分為CAE高、中、低劑量組和對照組，CAE高、中、低劑量組分別加入終濃度為30、20、10 mg/mL的CAE，對照組不予特殊處理，作用24 h。

1.3.2 細胞增殖能力觀察 采用MTT法。各組均設置3個復孔，向每孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續培養4 h。棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，室溫避光孵育5 min。采用酶標儀檢測各孔490 nm處的光密度(OD)值，計算細胞存活率。

1.3.3 細胞凋亡能力觀察 采用流式細胞術。取各組細胞，1 000 r/min離心6 min，PBS洗滌。加入結合緩沖液500 μL，依次加入Annexin V-FITC與PI各5 μL，充分混勻。室溫振蕩搖晃孵育10 min，置于流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.4 細胞miR-329-3p、TMBIM6 mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。取各組細胞，采用TRIzol法提取總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度。參照反轉錄試劑盒說明書操作，將總RNA反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR反應。miR-329-3p上游引物5′-GGGAACACACCTGGTTAAC-3′，下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;內參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。TMBIM6上游引物5′-CATCAACCCCAGCATCCTTC-3′，下游引物5′-ACCAGCCCCACATACAAGTT-3′;內參GAPDH上游引物5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′，下游引物5′-TGAAGGGGTCATTGATGGCA-3′。上述引物均由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。miR-329-3p以U6為內參，TMBIM6以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-329-3p、TMBIM6 mRNA相對表達量。

1.3.5 細胞TMBIM6、Cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取各組細胞，加入RIPA裂解液，冰上孵育15 min；4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min，吸取上清蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，取40 μg蛋白樣品加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮10 min使蛋白變性。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜、封閉，加入TMBIM6、Cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax、內參GAPDH一抗(稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌，加入二抗(稀釋比例均為1∶2 000)，室溫孵育1 h。TBST洗滌，暗室內曝光顯影，Image J軟件分析各條帶灰度值。以目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值計算目的蛋白相對表達量。

1.4 miR-329-3p與TMBIM6的相互作用觀察 starBase預測結果顯示，TMBIM6的3′UTR中含有與miR-329-3p互補的核苷酸序列，證實miR-329-3p與TMBIM6存在結合位點，見圖1。①雙熒光素酶報告實驗：將含有結合位點的序列插入熒光素酶報告基因載體，構建野生型報告質粒WT-TMBIM6。利用基因突變技術將結合位點進行突變，將含有突變位點的序列插入熒光素酶報告基因載體，構建突變型報告質粒MUT-TMBIM6。參照Lipofectamine2000轉染試劑說明書，分別將WT-TMBIM6、MUT-TMBIM6與miR-NC、miR-329-3p mimics共轉染至Huh7細胞，繼續培養24 h。采用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測各組熒光素酶活性，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。②Western blotting法：參照Lipofectamine2000轉染試劑說明書，分別將miR-NC、miR-329-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-329-3p轉染至Huh7細胞，參照1.3.5，采用Western blotting法檢測TMBIM6蛋白相對表達量。

圖1 starBase預測結果

1.5 miR-329-3p對CAE作用后Huh7細胞增殖、凋亡的影響觀察

1.5.1 細胞分組處理 取對數期Huh7細胞，以1×104/孔接種于6孔板，待細胞生長融合度達70%時，將培養基更換為不含血清的培養基。將細胞分為CAE+anti-miR-NC組、CAE+anti-miR-329-3p組，分別參照Lipofectamine2000說明書將anti-miR-NC、anti-miR-329-3p轉染至Huh7細胞，并加入終濃度為30 mg/mL的CAE處理24 h。

1.5.2 細胞增殖能力觀察 參照1.3.2，采用MTT法檢測細胞存活率。

1.5.3 細胞凋亡能力觀察 參照1.3.3，采用流式細胞術檢測細胞凋亡率。

1.5.4 細胞miR-329-3p表達檢測 參照1.3.4，采用實時熒光定量PCR法檢測細胞miR-329-3p表達。

1.5.5 細胞TMBIM6及Cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表達檢測 參照1.3.5，采用Western blotting法檢測細胞TMBIM6、Cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表達。

2 結果

2.1 CAE高、中、低劑量組和對照組細胞存活率、細胞凋亡率比較 CAE高、中、低劑量組和對照組細胞存活率依次升高，細胞凋亡率依次降低，兩組間比較P均<0.05。見表1。

表1 CAE高、中、低劑量組和對照組細胞存活率、細胞凋亡率比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與CAE低劑量組比較，#P<0.05；與CAE中劑量組比較，&P<0.05。

2.2 CAE高、中、低劑量組和對照組細胞miR-329-3p、TMBIM6表達比較 CAE高、中、低劑量組和對照組細胞miR-329-3p表達依次降低，而TMBIM6 mRNA和蛋白表達均依次升高，兩組間比較P均<0.05。見表2。

表2 CAE高、中、低劑量組和對照組細胞miR-329-3p、TMBIM6表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與CAE低劑量組比較，#P<0.05；與CAE中劑量組比較，&P<0.05。

2.3 CAE高、中、低劑量組和對照組細胞凋亡相關蛋白表達比較 CAE高、中、低劑量組和對照組細胞Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達均依次升高，p21、Bax蛋白表達均依次降低，兩組間比較P均<0.05。見表3。

表3 CAE高、中、低劑量組和對照組細胞凋亡相關蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與CAE低劑量組比較，#P<0.05；與CAE中劑量組比較，&P<0.05。

2.4 miR-329-3p與TMBIM6的相互作用 ①雙熒光素酶報告實驗結果顯示，共轉染MUT-TMBIM6+miR-329-3p的Huh7細胞熒光素酶活性為1.03±0.13，共轉染MUT-TMBIM6+miR-NC的Huh7細胞為1.02±0.09，二者比較P>0.05；共轉染WT-TMBIM6+miR-329-3p的Huh7細胞熒光素酶活性為0.45±0.10，共轉染WT-TMBIM6+miR-NC的Huh7細胞為1.01±0.16，二者比較P<0.05。②Western blotting檢測結果顯示，轉染miR-NC、miR-329-3p mimics的Huh7細胞TMBIM6蛋白相對表達量分別為0.86±0.13、0.41±0.08，二者比較P<0.05；轉染anti-miR-NC、anti-miR-329-3p的Huh7細胞TMBIM6蛋白相對表達量分別為0.90±0.11、1.05±0.10，二者比較P<0.05。

2.5 CAE+anti-miR-NC組、CAE+anti-miR-329-3p組細胞存活率、細胞凋亡率及miR-329-3p表達比較 與CAE+anti-miR-NC組比較，CAE+anti-miR-329-3p組細胞存活率升高，細胞凋亡率、miR-329-3p表達均降低(P均<0.01)。見表4。

表4 兩組細胞存活率、凋亡率及miR-329-3p表達比較

注：與CAE+anti-miR-NC組比較，*P<0.01。

2.6 CAE+anti-miR-NC組、CAE+anti-miR-329-3p組TMBIM6及凋亡相關蛋白表達比較 與CAE+anti-miR-NC組比較，CAE+anti-miR-329-3p組細胞TMBIM6、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達均升高，p21、Bax蛋白表達均降低(P均<0.01)。見表5、圖2。

表5 兩組細胞TMBIM6及凋亡相關蛋白表達比較

注：與CAE+anti-miR-NC組比較，*P<0.01。

圖2 兩組TMBIM6及細胞凋亡相關蛋白表達(Western blotting法)

3 討論

研究表明，中藥可通過調控肝癌細胞增殖、凋亡等生物學過程而發揮抗肝癌作用[9,10]。但中藥治療過程中涉及多種基因或信號通路，目前關于中藥提取物治療腫瘤的分子機制尚未闡明。既往研究顯示，山慈菇對肺癌、胃癌等腫瘤細胞的增殖均具有明顯的抑制作用[11,12]，CAE可能通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路激活，而抑制胃癌細胞增殖[13]。與上述研究結果相似，本研究結果顯示，隨著加入CAE濃度的升高，肝癌細胞存活率逐漸降低，細胞凋亡率逐漸升高；這提示CAE可有效抑制肝癌細胞增殖，并促進其凋亡。

Cyclin D1可正向調控細胞周期，促進細胞周期由G1期進入S期，從而促進細胞增殖。p21可抑制細胞周期進展，并可誘導細胞周期阻滯于G1期，從而抑制細胞增殖[14]。細胞增殖、凋亡失衡與腫瘤的發生過程密切相關，Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白，Bax表達升高后可通過激活線粒體途徑誘導細胞凋亡[15]。本研究結果顯示，隨著加入CAE濃度的升高，細胞Cyclin D1及Bcl-2蛋白表達均逐漸降低，p21及Bax蛋白表達均逐漸升高；這提示CAE可能通過上調p21表達、下調Cyclin D1表達而抑制肝癌細胞增殖，同時可能通過調控線粒體途徑而促進肝癌細胞凋亡。

miR-329-3p在宮頸癌細胞中呈低表達，上調miR-329-3p表達可抑制腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲[16,17]。本研究結果顯示，隨著加入CAE濃度的升高，肝癌細胞miR-329-3p表達逐漸升高，提示CAE可能通過上調miR-329-3p表達而發揮抗腫瘤作用。本研究通過雙熒光素酶報告實驗與Western blotting法證實miR-329-3p能夠靶向結合TMBIM6，并可負向調控TMBIM6的表達，由此推測miR-329-3p可能通過負靶向調控TMBIM6表達而發揮作用。本研究結果顯示，與CAE+anti-miR-NC組比較，CAE+anti-miR-329-3p組細胞存活率及TMBIM6、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達均升高，細胞凋亡率、miR-329-3p表達及p21、Bax蛋白表達均降低；提示抑制miR-329-3p表達可明顯降低CAE對肝癌細胞增殖及凋亡的影響，并可上調TMBIM6表達，說明CAE可能通過上調miR-329-3p表達、抑制其靶基因TMBIM6表達而抑制肝癌細胞增殖，并促進細胞凋亡。

綜上所述， CAE可抑制肝癌細胞增殖、促進細胞凋亡，其機制可能與激活miR-329-3p表達并負向調控其靶基因TMBIM6有關。