miR-590-3p對結直腸癌細胞順鉑耐藥的影響及其機制

徐明，唐澍，劉琦，黃姝娟

郴州市第一人民醫院，湖南郴州423000

結直腸癌(CRC)是全世界發病率最高的癌癥，手術切除、化學治療和放射治療是其主要治療手段，但患者5年生存率較低[1,2]。順鉑(DDP)是CRC治療的常用化療藥物，DDP耐藥是導致CRC治療失敗的重要原因[3,4]。miR-590-3p是一種與腫瘤發生相關的新型微小RNA(miRNA)，可在不同腫瘤中作為促癌因子或者抑癌因子，參與腫瘤的發生發展[5]。研究表明，miR-590-3p在CRC組織中表達升高，并可促進CRC細胞的增殖和侵襲能力[6]。但是，miR-590-3p是否參與腫瘤細胞DDP耐藥目前鮮見報道。2017年3月～2019年8月，本研究觀察了miR-590-3p對CRC細胞DDP耐藥的影響，并探討其可能的機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：CRC細胞系SW480、SW620、HCT116和正常結腸上皮細胞系NCM460均購自美國ATCC細胞庫。主要試劑：胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，蛋白裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；ULtraRT one step RT-PCR Kit購自北京百奧萊博科技有限公司，蛋白濃度檢測試劑盒和上樣緩沖液均購自上海碧云天生物技術有限公司，CCK-8試劑購自美國GlpBio公司，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司；miR-590-3p inhibitor、miR-590-3p mimic、NC質粒、pGLO-LRIG1-野生型(wt)質粒和pGLO-LRIG1-突變型(mut)質粒均購自上海吉瑪制藥技術有限公司，MDR1、Bax和Bcl-2抗體均購自美國Proteintech公司。miR-590-3p、富含亮氨酸的重復序列和免疫球蛋白樣結構域蛋白1(LRIG1)、內參U6和GAPDH引物均由美國Invitrogen有限公司設計合成。

1.2 miR-590-3p高表達細胞篩選 采用實時熒光定量PCR法。將CRC細胞系SW480、SW620、HCT116和正常結腸上皮細胞系NCM460快速復蘇，重懸至含有10% FBS的細胞培養基中，在37 ℃、5% CO2的全濕培養箱中進行培養。待細胞融合至95%左右時，進行傳代培養。取傳代培養的各種細胞，加入TRIzol試劑進行裂解，采用氯仿異丙醇試劑提取的方法提取細胞總RNA，并檢測RNA濃度及純度合格。按照ULtraRT one step RT-PCR Kit試劑盒說明書配制25 μL的反應體系：2×ULtraRT one step Buffer 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，ULtraRT one step EnzymeMix 0.5 μL，RNA 1 μL，用無RNA酶的雙蒸水補足至25 μL。采用7500PCR儀進行PCR擴增反應，miR-590-3p上游引物5′- AAAGATTCCAAGAAGCTAAGGGTG-3′(24 bp)，下游引物5′-CCTAACTGGTTTCCTGTGCCTA-3′(22 bp)；內參U6上游引物5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(17 bp)，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(20 bp)。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環，72 ℃終延伸5 min。采用2-ΔΔCt法計算miR-590-3p相對表達量。結果顯示，CRC細胞系SW480、SW620、HCT116中miR-590-3p相對表達量分別為9.84±0.79、10.62±0.87、3.95±0.26，正常結腸上皮細胞系NCM460為1.00±0.01；3種CRC細胞中miR-590-3p相對表達量均高于NCM460細胞，其中SW620細胞miR-590-3p相對表達量最高(P均<0.05)。選取miR-590-3p表達最高的CRC細胞系SW620用于后續實驗。

1.3 DDP耐藥的SW620細胞(DDP/SW620細胞)篩選及驗證

1.3.1 DDP/SW620細胞篩選 采用持續接觸、濃度遞增的方法篩選DDP/SW620細胞[7]，最終篩選出加入18 μg/mL DDP的培養基中穩定生長的SW620細胞。用含有2 μg/mL DDP的培養基培養該DDP/SW620細胞，并用于后續實驗。

1.3.2 DDP/SW620細胞驗證 采用CCK-8法。取SW620、DDP/SW620細胞，以1.5×103/孔接種至96孔板，細胞貼壁后分別加入不同濃度的DDP(0、0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 μg/mL)，作用48 h。更換含有10 μL CCK-8試劑的培養基100 μL，設置空白對照孔，孵育1 h，檢測490 nm波長處的光密度(OD)值。細胞存活率=加藥孔OD值/空白對照孔OD值，計算兩種細胞的DDP半數抑制濃度(IC50)。

1.4 SW620、DDP/SW620細胞miR-590-3p表達檢測 取生長狀況良好的SW620、DDP/SW620細胞，參照1.2步驟，采用實時熒光定量PCR法檢測miR-590-3p相對表達量。

1.5 miR-590-3p對DDP/SW620細胞DDP耐藥的影響觀察

1.5.1 細胞分組轉染及驗證 將DDP/SW620細胞以1.5×103/孔接種至96孔板，隨機分為miR-590-3p inhibitor組和NC組。細胞貼壁8 h時，按照脂質體2000說明書分別轉染miR-590-3p inhibitor、NC質粒，置于37 ℃、5% CO2的全濕培養箱中培養，12 h更換新鮮培養基。轉染6 h，參照1.2步驟，采用實時熒光定量PCR法檢測miR-590-3p相對表達量。

1.5.2 細胞DDP耐藥觀察 兩組轉染6 h，分別加入不同終濃度的DDP(0、0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160 μg/mL)，作用48 h。參照1.3.2步驟，采用CCK-8法檢測細胞存活率，計算DDP的IC50。

1.6 miR-590-3p對其靶基因的調控作用觀察 采用TargetScan7.1軟件(http://www.targetscan.org/)預測miR-590-3p的靶基因為LRIG1，LRIG1啟動子區與miR-590-3p具有結合位點。①雙熒光素酶報告實驗：將DDP/SW620細胞以1.5×103/孔接種至96孔板，隨機分為四部分，按照脂質體2000說明書分別轉染pGLO-LRIG1-wt+NC質粒、pGLO-LRIG1-wt+miR-590-3p mimic質粒、pGLO-LRIG1-mut+NC質粒、pGLO-LRIG1-mut+miR-590-3p mimic質粒。轉染48 h，根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑說明書檢測細胞熒光素酶活性。②實時熒光定量PCR法：將DDP/SW620細胞以1.5×103/孔接種至96孔板，隨機分為兩部分，分別轉染miR-590-3p mimic質粒和NC質粒。轉染48 h，參照1.2步驟，采用實時熒光定量PCR法檢測LRIG1 mRNA相對表達量。LRIG1上游引物5′-CTGGACGCGGAGCCTAAAC-3′(19 bp)，下游引物5′- TGTAGGTTCGGCAAGTCCTCA-3′(21 bp)；內參GAPDH上游引物5′-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′(20 bp)，下游引物5′-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3′(20 bp)。

1.7 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。兩組轉染6 h，加入終濃度為10 μg/mL的DDP，作用48 h。采用Annexin V-FITC/PI染色試劑盒進行細胞染色，染色5～15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 細胞LRIG1、耐藥相關基因MDR1和凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2蛋白表達檢測 采用Western blotting法。兩組轉染6 h，加入終濃度為10 μg/mL的DDP，作用48 h。收集細胞，加入細胞裂解液，裂解完全后高速離心獲取上清總蛋白。檢測蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液煮沸變性；50 μg蛋白加樣進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，蛋白電濕轉移至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉，室溫孵育PVDF膜1 h。分別加入LRIG1、MDR1、Bax、Bcl-2、內參GAPDH一抗(稀釋比例分別為1∶500、1∶1 000、1∶500、1∶1 000、1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；加入二抗(稀釋比例均為1∶8 000)，室溫孵育1 h。增強型化學發光試劑曝光、顯影，采用Image J軟件分析條件灰度值。LRIG1、MDR1、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量以目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值表示。

2 結果

2.1 DDP/SW620細胞驗證結果 SW620、DDP/SW620細胞經不同濃度DDP作用后的細胞存活率見圖1。SW620、DDP/SW620細胞DDP的IC50分別為(1.28±0.17)、(5.68±0.38)μg/mL，二者比較P<0.05。

圖1 SW620、DDP/SW620細胞經不同濃度DDP作用后的細胞存活率(CCK-8法)

2.2 SW620、DDP/SW620細胞miR-590-3p表達比較 SW620、DDP/SW620細胞miR-590-3p相對表達量分別為1.00±0.01、19.54±0.41，二者比較P<0.05。

2.3 兩組miR-590-3p相對表達量比較 miR-590-3p inhibitor組和NC組miR-590-3p相對表達量分別為0.33±0.04、1.00±0.00，兩組比較P<0.05。

2.4 兩組DDP的IC50比較 miR-590-3p inhibitor組和NC組經不同濃度DDP作用后的細胞存活率見圖2。miR-590-3p inhibitor組和NC組DDP的IC50分別為(2.46±0.31)、(5.50±0.75)μg/mL，兩組比較P<0.05。

2.5 miR-590-3p對LRIG1的靶向調控作用觀察結果 ①雙熒光素酶報告實驗結果：轉染pGLO-LRIG1-wt+NC質粒、pGLO-LRIG1-wt+miR-590-3p mimic質粒的DDP/SW620細胞熒光素酶活性分別為1.00±0.01、0.28±0.03，二者比較P<0.01；轉染pGLO-LRIG1-mut+NC質粒、pGLO-LRIG1-mut+miR-590-3p mimic質粒的DDP/SW620細胞熒光素酶活性分別為1.00±0.05、0.90±0.20，二者比較P>0.05。②實時熒光定量PCR檢測結果：轉染miR-590-3p mimic質粒和NC質粒的DDP/SW620細胞LRIG1 mRNA相對表達量分別為0.31±0.04、1.00±0.05，二者比較P<0.05。

圖2 兩組經不同濃度DDP作用后的細胞存活率(CCK-8法)

2.6 兩組細胞凋亡率比較 miR-590-3p inhibitor組和NC組細胞凋亡率分別為14.87%±0.39%、3.28%±0.17%，兩組比較P<0.05。見圖3。

圖3 兩組細胞凋亡情況(流式細胞術)

2.7 兩組LRIG1、MDR1、Bax、Bcl-2蛋白表達比較 miR-590-3p inhibitor組LRIG1、Bax蛋白相對表達量均高于NC組，MDR1、Bcl-2蛋白相對表達量均低于NC組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組LRIG1、MDR1、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較

注：與NC組比較，*P<0.05，#P<0.01。

3 討論

CRC早期患者經根治性手術切除后預后相對較好，患者5年生存率為60%左右，但由于CRC早期癥狀不明顯，約20%的患者確診時伴有轉移并處于疾病晚期，從而喪失手術機會；同時，CRC早期患者在根治性手術治療后5年內復發率為30%左右，目前對于轉移和復發的患者主要采取化療，但患者多存在化療耐藥，導致轉移和復發患者5年生存率僅為14.2%[2]。miRNA是一類長18～22個核苷酸的非編碼小RNA，大量研究已經證實miRNA在腫瘤發生發展過程中發揮重要作用，同時參與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移和耐藥等生物學行為，是抗腫瘤治療的相關靶點[5]。研究報告，miR-590-3p在卵巢癌和胃癌等腫瘤中具有促進腫瘤惡性進展的作用[8,9]。而miR-590-3p在乳腺癌和骨肉瘤等腫瘤組織中呈低表達，具有抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移的作用[10,11]。因此，miR-590-3p在不同腫瘤發生過程中發揮不同的生物學功能。Feng等[6]報道，miR-590-3p在CRC細胞和組織中表達上調，并可促進細胞增殖和球體形成。Sun等[12]發現，miR-590-3p在CRC組織中表達升高，并與患者TNM分期、遠處轉移和總體生存率低有關，過表達miR-590-3p可促進CRC細胞的增殖、侵襲和遷移。

目前，關于miR-590-3p是否參與腫瘤細胞耐藥的研究比較少。文獻報道，miR-590-3p與神經膠質瘤和膽囊癌細胞的放射抗性相關[13,14]。芯片數據庫顯示，miR-590-3p可能是影響CRC患者放化療敏感性的miRNA之一[15]。但是，關于miR-590-3p是否參與CRC細胞DDP化療耐藥鮮見報道。本研究結果顯示，CRC細胞系SW480、SW620、HCT116中miR-590-3p相對表達量均高于正常結腸上皮細胞系NCM460，表明CRC細胞中miR-590-3p表達升高。本研究中SW620細胞miR-590-3p相對表達量最高，因此選擇該細胞建立DDP耐藥細胞株；結果顯示，DDP/SW620細胞中miR-590-3p相對表達量及DDP的IC50均高于SW620細胞，而沉默miR-590-3p表達后DDP/SW620細胞DDP的IC50降低，表明miR-590-3p可促進CRC細胞發生DDP耐藥。

miRNA可通過與靶信使RNA(mRNA)的3′UTR互補結合，選擇性靶向mRNA而調節基因表達[5]。LRIG1是一種跨膜蛋白，可拮抗上皮組織中的表皮生長因子受體信號傳導，屬于抑癌基因[16]。研究報道，LRIG1參與CRC細胞西妥昔單抗(CTX)耐藥，其在CTX抗性CRC細胞中表達升高，在CTX治療敏感患者中LRIG1表達與CRC病情嚴重程度呈負相關關系[17]。在人神經膠質瘤細胞中，miR-590-3p可通過靶向LRIG1基因，促進細胞的放射抗性[13]。本研究采用TargetScan7.2預測軟件和雙熒光素酶報告實驗均證實在CRC細胞中LRIG1是miR-590-3p的靶基因。本研究結果顯示，抑制miR-590-3p表達后DDP/SW620細胞LRIG1蛋白表達升高；這提示miR-590-3p可能通過靶向LRIG1參與CRC細胞發生DDP耐藥，但是其具體的分子機制仍需深入研究。

化療藥物促進腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤治療的重要機制之一[18]。腫瘤細胞耐藥的主要機制與跨膜蛋白的過表達密切相關，這些蛋白質可以直接降低細胞內化療藥物的濃度。MDR1也稱為P-糖蛋白，是第一個被確認為人類哺乳動物ABC轉運蛋白的蛋白，其高表達可促進腫瘤的多藥耐藥[19]。Bcl-2是重要的抗凋亡相關蛋白，是Bcl-2家族中最重要的基因，其通過降低凋亡蛋白酶激活而促進細胞存活。同時Bcl-2可被促凋亡蛋白Bax調控，放化療主要是通過調節Bcl-2、Bax表達，促進腫瘤細胞凋亡，從而發揮抗腫瘤作用[20]。本研究發現，miR-590-3p inhibitor組細胞凋亡率、Bax蛋白表達均高于NC組，MDR1、Bcl-2蛋白表達均低于NC組，表明干擾miR-590-3p表達可促進細胞凋亡、降低耐藥相關基因MDR1及抗凋亡蛋白Bcl-2表達。

綜上所述，miR-590-3p可促進CRC細胞發生DDP耐藥，其機制可能與負性調控LRIG1進而促進MDR1表達及減少細胞凋亡有關。