基于信息熵理論的黃芪三七復方提取工藝優選△

張仕瑾，蘭楊a，王婭俐，郭廷東，張燕，唐志立，謝席勝

1.川北醫學院 第二臨床醫學院/南充市中心醫院 藥學部，四川 南充 637000；2.個體化藥物治療南充市重點實驗室，四川 南充 637000；3.川北醫學院 第二臨床醫學院/南充市中心醫院 腎內科，四川 南充 637000

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是指各種原因引起的慢性腎臟結構和功能障礙(腎臟損害病史>3個月)[1]。我國18周歲以上的成年人群中CKD的患病率為10.8%[2]。CKD多呈進行性進展，約有2%患者會進入終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)階段，需要通過透析或腎移植等腎臟替代治療來維持生命[3]。中醫藥在慢性疾病的綜合防治方面有著獨特的優勢，能有效改善CKD患者的生活質量，減緩CKD的進程，并能減少化學藥物帶來的不良反應[4]。黃芪三七復方是南充市中心醫院腎內科謝席勝主任醫師的臨床經驗方，該處方由黃芪、三七、當歸、牛膝等組成，具有益氣養血、活血利水、健脾助運的功效。前期基礎研究表明，該復方能提高血清白蛋白水平，降低尿蛋白及血脂，調節免疫進而延緩CKD進展，提高患者生活質量[5]。本研究以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb15個組分的提取量及浸膏得率為評價指標，結合信息熵理論賦予指標客觀的權重系數，計算綜合評分，采用正交試驗篩選最佳提取工藝參數，為后期中試及制劑生產提供研究基礎。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀，包括四元泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器(PDA)(日本島津公司)；MS105DU型十萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多國際有限公司)；JY10002型電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；UPH-1V-20T型超純水制造系統(四川優普超純科技有限公司)。

1.2 試藥

對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號：111920-201606，純度：97.6%)、阿魏酸(批號：110773-201614，純度：99.0%)、三七皂苷R1(批號：110745-201820，純度：93.1%)、人參皂苷Rg1(批號：110703-201832，純度：92.4%)、人參皂苷Rb1(批號：110704-201827，純度：91.2%)均購自中國食品藥品檢定研究院；水為超純水；甲醇、乙腈為色譜級；其余試劑為均為分析級。

試驗所用飲片均購自四川省中藥飲片有限公司，經南充市中心醫院藥學部張燕主任中藥師鑒定：黃芪(批號：180829，產自甘肅)為膜夾黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根；三七(批號：190219，產自云南)為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根和根莖；當歸(批號：190104，產自甘肅)為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根；牛膝(批號：190220，產自河南)為莧科植物牛膝AchyranthesbidentataBl.的干燥根；昆布(批號：181212，產自山東)為海帶科植物海帶LaminariajaponicaAresch.或翅藻科植物昆布EckloniakuromeOkam.的干燥葉狀體；薏苡仁(批號：190211，產自貴州)為禾本科植物薏苡仁Coixlacryma-jobiL.var.mayuen(Roman.)Stapf的干燥成熟種仁；山藥(批號：190129，產自河南)為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖；甘草(批號：190212，產自新疆)為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法的建立

2.1.1色譜條件 色譜柱：SHIMADZU C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1% 磷酸水(B)，梯度洗脫(0～13 min，19%A，13～60 min，19%～37%A)；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；檢測波長：203 nm(三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1)、260 nm(毛蕊異黃酮葡萄糖苷)、320 nm(阿魏酸)[6-7]。

2.1.2混合對照品溶液的制備 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含毛蕊異黃酮葡萄糖苷47.2 μg·mL-1、阿魏酸101.5 μg·mL-1、三七皂苷R1111.3 μg·mL-1、人參皂苷Rg187.0 μg·mL-1、人參皂苷Rb1102.3 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備 精密吸取正交試驗提取液10 mL，置25 mL量瓶中，加75% 甲醇稀釋，振搖，定容至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.1.4系統適用性試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣分析。結果見圖1，各色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子為0.93～1.05，理論板數以毛蕊異黃酮葡萄糖苷計不低于5000。

注；A.混合對照品；B.供試品；1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Rb1；4.毛蕊異黃酮葡萄糖苷；5.阿魏酸。圖1 混合對照品和黃芪三七復方的HPLC圖

2.1.5線性關系考察 精密吸取上述混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以進樣量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線，得線性范圍和回歸方程(表1)，結果表明，各成分在進樣范圍內線性關系良好。

表1 黃芪三七復方中5種成分的線性范圍和回歸方程

2.1.6精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按2.1.1項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為0.76%、0.46%、0.79%、0.82%、0.69%，表明儀器精密度良好。

2.1.7穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、4、8、12、18、24 h按2.1.1項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為1.37%、1.82%、1.07%、1.54%、0.98%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.1.8重復性試驗 取同一提取液按2.1.3項下方法制備6份供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為1.10%、1.03%、1.21%、0.89%、0.74%，表明方法重復性良好。

2.1.9加樣回收率試驗 吸取已知含量的提取液5 mL 至25 mL量瓶中，平行6份，分別加入混合對照品溶液(按2.1.2項下方法制成含毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1分別為0.073、0.148、0.242、0.865、0.631 mg·mL-1的混合對照品溶液)1 mL，按2.1.1項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 黃芪三七復方中5種成分的加樣回收率試驗結果

2.1.10浸膏率的測定 精密吸取提取液50 mL，置干燥至質量恒定的蒸發皿中(M1)，水浴蒸干，轉移至烘箱中，105 ℃干燥3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質量(M2)，計算浸膏率。

(1)

式中，M為處方藥材總質量，V為提取液體積。

2.2 信息熵理論結合正交試驗優選提取工藝

2.2.1正交試驗因素水平與結果 在前期單因素試驗的基礎上，選擇加水倍數(A)、提取時間(B)、提取次數(C)作為正交試驗考察因素，每個因素3個水平，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量及干膏率的綜合評分為評價指標，采用正交試驗表L9(34)

進行試驗，因素水平表見表3，試驗結果見表4。

表3 黃芪三七復方水提取的因素水平

表4 黃芪三七復方L9(34)水提取正交試驗設計與結果

2.2.2應用信息熵理論賦予指標客觀權重 參考相關文獻，建立評價指標的原始矩陣(X)，再將其轉化成概率矩陣(P)[8-10]，結果如下。

根據概率矩陣(P)，計算各指標的信息熵(Hi)，得到：

Hi=[0.991 1 0.995 6 0.995 4 0.996 4 0.993 0 0.996 0]

根據指標的Hi，計算指標的權重系數(Wi)，得到：

Wi=[0.272 9 0.135 3 0.142 9 0.110 9 0.215 3 0.122 7]

對于具有m行n列的概率矩陣，綜合評分按公式(2)計算。

Mm=P1m×W1+P2m×W2+P3m×W3+…+Pnm×Wn

(2)

2.2.3正交試驗結果分析 由表4的極差分析結果(R)可知，各因素對綜合評分的影響大小為C>A>B>D，由表5的方差分析結果，可知提取次數對綜合評分的影響差異有統計學意義(P<0.05)。因此，確定提取工藝為A2B1C3，即加10倍量水，提取4次，每次30 min。

表5 黃芪三七復方水提取工藝參數方差分析

2.2.4驗證實驗 為驗證工藝的可靠性，按處方比例稱取4倍量藥材(共644 g)，平行3份，按上述確定的工藝重復3次，依法測定各指標含量和浸膏率，結果見表6。各指標的提取量均較高，平均綜合評分為0.133 7，RSD為0.94%，結果表明優選的工藝穩定可行。

表6 黃芪三七復方水提取工藝驗證實驗結果

3 討論

黃芪三七復方臨床主要用于治療慢性腎臟病3～4期患者，具有益氣養血、活血利水、健脾助運的功效，能使氣血健旺、瘀血消散，進而使廢用的腎臟得以一定程度的恢復。本方中黃芪味甘，性微溫，歸脾、肺經，可益氣活血、升陽健脾、利水消腫為君藥；三七活血化瘀兼有補血作用，當歸活血養血，兩者協同黃芪補血活血作用為臣藥。黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷通過激活磷脂酰肌醇3-激酶和蛋白激酶B(PI3K/Akt)途徑減輕體內缺血再灌注損傷[11]。三七中皂苷類成分能改善微循環、抗炎、增強機體免疫力，具有抗腎間質纖維化、抗腎臟氧化損傷、保護腎臟作用[12-14]。當歸中阿魏酸能保護血管內膜，具有抗動脈粥樣硬化的作用。有研究表明，阿魏酸鈉鹽能促進大鼠腎炎癥狀明顯改善[15]。因此，本實驗選擇與治療作用相關的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1作為含量指標成分，能較全面地評價提取工藝。

前期實驗中對加水倍數、提取時間、提取次數、浸泡時間進行了單因素考察，結果浸泡時間對結果幾乎無影響，故將加水倍數、提取時間、提取次數作為正交試驗考察因素。在建立多指標含量測定方法時，考察了等度洗脫和梯度洗脫2種方式，結果等度洗脫指標峰分離度差，且出峰時間間隔較長。同時還考察不同色譜系統如甲醇-水、甲醇-磷酸水、乙腈-水、乙腈-磷酸水等。由于阿魏酸在酸性條件下峰形較好，拖尾現象能得到極大改善，最終確定乙腈-0.1%磷酸水作為流動相，進行梯度洗脫，結果樣品中各指標峰峰形較好，拖尾因子為0.93～1.05，分離度均大于1.5。

目前，信息熵理論在中藥復方提取工藝中得到了廣泛應用，該理論能很好地解決評價指標的客觀賦權問題[16-17]。通過對實驗數據的數理分析，指標成分在不同條件下的客觀變化規律被揭示，變異程度越大、信息熵越小、提供的信息越多、權重系數越大，反之權重系數越小。本研究以5種指標成分的含量及浸膏率的綜合評分為評價指標，應用信息熵理論賦予各指標客觀的權重系數，實現對正交試驗提取工藝參數的優選，優化后的黃芪三七復方提方提取工藝為加10倍量水，提取4次，每次30 min。該方法避免了主觀因素對試驗結果的干擾，使結果更客觀和嚴謹，優化的提取工藝重復性好、穩定可靠，為該處方的進一步開發提供參考。