腫瘤壞死因子-α和β1,4-半乳糖基轉移酶-Ⅰ在膝關節滑膜炎中的表達及臨床意義

鄭舒凌，王 治，張建華，鄒龍飛，薛 浩

骨關節是指骨與骨間連接的組織，而膝關節骨性關節炎是發生于膝蓋處骨關節間的炎性反應[1]。膝關節炎是一種以關節軟骨面的退行性病變和繼發性骨質增生為主要改變的慢性關節病[2]。該病的發生一般與患者年齡、體重指數、創傷以及遺傳因素相關，患有該疾病的患者常會出現關節僵硬、腫脹、疼痛及活動受限等癥狀，對人們的日常生活造成了較大的影響[3]。臨床常誤診為類風濕性關節炎，而有相關研究顯示，類風濕性關節炎與膝關節骨性關節炎發生炎性反應的環境極為相似，且滑膜發生炎癥引起的軟骨退變與膝關節骨性關節炎的病變具有緊密聯系[4]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)和β1,4-半乳糖基轉移酶-Ⅰ(β1,4-Galactosyltransferase-Ⅰ， β1,4-GalT-Ⅰ)是人體內最常見的炎性因子。有大量文獻報道，上述兩種因子對關節病變的發生具有重要意義[5]。本研究通過回顧性分析本院確診的109例膝關節滑膜炎患者滑膜組織成纖維樣滑膜細胞中的TNF-α、β1,4-GalT-Ⅰ表達變化情況，旨在分析上述因子水平與膝關節滑膜炎的相關性以及TNF-α是否會誘導滑膜組織β1,4-GalT-Ⅰ的分泌及表達。現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年11月—2019年11月于本院就診的膝關節滑膜炎109例作為研究組。納入標準：所有患者均經X線等檢查符合膝關節滑膜炎診斷標準[6]；均未合并其他內科疾病或感染性疾病患者；臨床資料均完整。排除標準：診斷為繼發性骨關節炎或類風濕性關節炎患者；臨床資料不完整者。選取同期進行膝關節探查各項結果均正常者57例作為對照組。2組年齡、性別等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組一般資料比較

注：研究組為膝關節滑膜炎患者，對照組為行膝關節探查各項結果正常者

1.2儀器與試劑 4%甲醛溶液、石蠟、Trazol溶液、PCR儀(美國ABI-7500 Real-Time PCR)、鼠源性TNF-α抗體(美國BD公司)、羊源性β1,4-GalT-Ⅰ抗體(美國BD公司)、經FITC標記的驢抗鼠抗體(美國BD公司)、經TRITC標記的驢抗羊抗體(美國BD公司)、TNF-α檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：E-EL-H2104c)。

1.3檢測方法

1.3.1PCR檢測:經關節鏡手術將膝關節滑膜組織取出，在5 min內將滑膜組織置于液氮中并放入-80℃的恒溫箱中待檢。于無菌環境下將滑膜組織進行剪碎和碾磨，由相關專業操作人員用Trazol溶液將滑膜組織樣本和總RNA進行提取，并嚴格按照試劑盒說明合成cRNA。所需引物、探針及序列見表2。合成完畢后取2組cRNA 1.5 μl，將其作為模板，再分別加入至2.5 μl 10×buffer和1 μl dNTP中，并經過高溫變性、循環，再進行PCR儀檢測。

表2 PCR檢測引物、探針及序列

1.3.2免疫熒光染色:抽取待檢的滑膜組織標本，并置于4%甲醛溶液中固定浸泡24 h，予以石蠟包埋切片。在對其進行染色時，應加入鼠源性TNF-α抗體以及羊源性β1,4-GalT-Ⅰ抗體，再放置于4℃的恒溫箱中進行孵育，時長約2 h，并應用磷酸鹽緩沖液漂洗3次，每次10 min。待多余水分除去后，再加入經TRITC標記的驢抗羊抗體以及經FITC標記的驢抗鼠抗體，放置于4℃的恒溫箱中孵育2 h，再用磷酸鹽緩沖液漂洗3次，每次10 min。

1.3.3TNF-α水平檢測:使用武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司生產的試劑盒并應用酶聯免疫吸附雙抗夾心法對TNF-α水平進行檢測。

1.4觀察指標 比較2組TNF-α及β1,4-GalT-Ⅰ表達情況，根據2組各指標表達情況，分析不同劑量、不同時長TNF-α對滑膜組織成纖維樣滑膜細胞中的β1,4-GalT-Ⅰ表達的影響。不同劑量：在相同時長TNF-α的刺激下，分別予以2組成纖維樣滑膜細胞0.1、1、3、5、7 ng/ml的TNF-α刺激，觀察β1,4-GalT-Ⅰ表達的變化情況；不同時間：2組成纖維樣滑膜細胞均予以5 ng/ml的TNF-α刺激，觀察不同時間段β1,4-GalT-Ⅰ表達的變化情況。

2 結果

2.1TNF-α、β1,4-GalT-Ⅰ表達水平 研究組TNF-α、β1,4-GalT-Ⅰ相對表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組TNF-α和β1，4-GalT-Ⅰ相對表達水平比較

注：研究組為膝關節滑膜炎患者，對照組為行膝關節探查各項結果正常者；TNF-α為腫瘤壞死因子-α，β1,4-GalT-Ⅰ為β1,4-半乳糖基轉移酶-Ⅰ；與對照組比較，bP<0.01

2.2不同劑量、不同時長的TNF-α刺激對滑膜組織成纖維樣滑膜細胞中的β1,4-GalT-Ⅰ表達的影響 不同劑量TNF-α刺激成纖維樣滑膜細胞，隨TNF-α劑量增加β1,4-GalT-Ⅰ表達水平不斷升高，5 ng/ml時β1,4-GalT-Ⅰ達到高峰，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，隨后又下降。見圖1。給予2組5 ng/ml TNF-α刺激，隨刺激持續時間逐漸延長β1,4-GalT-Ⅰ的表達水平逐漸上升，直至4 h時達到高峰，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，隨后下降。見圖2。

圖1 不同劑量TNF-α刺激對滑膜組織成纖維樣滑膜細胞中的β1,4-GalT-Ⅰ表達的影響

TNF-α為腫瘤壞死因子-α，β1,4-GalT-Ⅰ為β1,4-半乳糖基轉移酶-Ⅰ，0.1、1、3、5、7 ng/ml為TNF-α劑量；與對照組比較，aP<0.05

圖2 不同時長的TNF-α刺激對滑膜組織成纖維樣滑膜細胞中的β1,4-GalT-Ⅰ表達的影響

TNF-α為腫瘤壞死因子-α，β1,4-GalT-Ⅰ為β1,4-半乳糖基轉移酶-Ⅰ，0.5、2、3、4、5、6、8、12 h為TNF-α刺激時間；與對照組比較，aP<0.05

3 討論

骨關節炎是一種以關節軟骨的變性、破壞及骨質增生為特征的慢性進行性骨關節病，常見于老年群體[7]。有研究報道，目前我國的骨關節炎發生率隨年齡增長呈上升趨勢[8]。目前臨床主要以緩解疼痛、延緩病情發展，保護關節功能為治療目標[9]。

骨性關節炎病理特點主要表現為關節軟骨的變性破壞、軟骨下骨硬化、關節邊緣骨質增生、滑膜增生等[10]。該病是由于各種炎性因子及炎性細胞作用于滑膜細胞組織，使其受刺激反應不斷增殖，逐漸形成具有侵襲性的血管翳，血管翳與病變組織周圍骨組織及軟骨組織反應，導致關節結構發生破壞，關節功能喪失[11-12]。為減少骨關節結構、功能破壞對人體造成的不可逆損傷，引發骨性關節炎主要致炎相關細胞因子的研究一直是臨床討論的熱點[13]。

有相關文獻證明，滑膜細胞受炎癥刺激分泌的炎性因子及細胞因子在骨關節炎發病及病情變化過程中具有促進作用，其中成纖維樣滑膜細胞就是其中的一種[14]。該細胞表達水平直接影響機體內各生長因子、黏附分子、促炎因子及基質金屬蛋白酶合成和表達[15]。β1,4-GalT-Ⅰ是由滑膜組織細胞分泌的炎性介質，其分泌位置不同發揮的生理學功能也不同[16]。有研究顯示，β1,4-GalT-Ⅰ是目前研究發現的唯一一種位于高爾基體上既可與細胞膜反應產生黏附作用，又可參與糖鏈合成反應的細胞酶，并參與細胞運動和信號的識別過程[17]。人體內β1,4-GalT-Ⅰ具有介導糖基轉移的作用，并參與機體的炎性應激和免疫調節過程[18]。

TNF-α是由單核細胞和巨噬細胞分泌的一種炎性反應介質[19]。有文獻證實，TNF-α可誘導前列腺素E2膠原酶的分泌以及滑膜細胞的合成，促進炎性反應的發生[20]。本研究結果發現，膝關節滑膜炎患者滑膜組織內TNF-α、β1,4-GalT-Ⅰ表達水平增高，驗證了上述研究結果，也在一定程度說明了TNF-α、β1,4-GalT-Ⅰ與膝關節滑膜炎發生有關。

在炎性反應中，TNF-α被證實可促進血管內皮細胞大量合成并分泌β1,4-GalT-Ⅰ，而是否具有誘導滑膜組織分泌β1,4-GalT-Ⅰ的作用仍需進一步探討[21]。本研究對滑膜組織中纖維樣滑膜細胞予以不同劑量及不同時長TNF-α刺激，研究發現，β1,4-GalT-Ⅰ表達水平隨刺激時長和劑量增加不斷上升，TNF-α刺激濃度達5 ng/ml時達到最高值，隨后逐漸降低；TNF-α刺激時長達4 h時達到高峰期，隨后也降低。與朱新輝等[22]研究結果一致。提示一定劑量和一定時長TNF-α刺激可誘導β1,4-GalT-Ⅰ分泌，并共同作用于滑膜組織，參與炎性反應。

綜上所述，TNF-α與β1,4-GalT-Ⅰ在膝關節滑膜炎的病變過程中發揮著重要作用，臨床可根據其表達情況進行有效地阻斷，這為膝關節滑膜炎的治療提供了可能性。