木香乙醇提取物對缺氧小鼠肝臟保護作用研究

靳婉君，郝 穎，樊鵬程，楊林鵬，馬慧萍

當低海拔地區人群進入高原后，由于高原的低壓、低氧等環境因素影響，機體對低氧環境的適應能力不全而發生的綜合征稱為高原病。缺氧時對人體勞動學習記憶都會發生影響[1]，且氧氣對生命活動有著重大的意義，當機體無法在氧化劑分子的生產和利用之間建立平衡時，會發生氧化應激[2]，在氧化應激期間活性氧(ROS)的過量產生可能導致蛋白質、DNA和脂質損傷，引起細胞損傷[3]。氧供缺乏會損傷線粒體氧化磷酸化和線粒體功能[4]，同時缺氧會導致線粒體膜電位降低,呼吸鏈電子傳遞受阻[5]，能量代謝障礙，從而導致線粒體的功能障礙。本課題組前期篩選發現木香提取物給藥后在常壓密閉實驗中小鼠存活時間延長率最高，故用70%乙醇提取木香藥材，給藥干預模擬缺氧小鼠，檢測線粒體膜電位，以及與三羧酸循環和氧化磷酸化相關的關鍵酶，從線粒體功能角度探討木香對肝臟的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1實驗動物：SPF級Balb/c雄性小鼠，體重(20±2)g，購買并飼養于聯勤保障部隊第九四〇醫院動物實驗科，合格證號：SYXK(軍)2017-0047。

1.1.2藥物：木香飲片(榆中縣農牧工商聯合公司隆興中藥材飲片加工廠，批號：20170923)，木香飲片粉碎，用4倍量70%乙醇浸泡過夜，超聲提取1 h，過濾，重復2次，合并濾液，濃縮，冷凍干燥，得木香70%乙醇提取物。

1.1.3試劑：線粒體膜電位試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，產品貨號：CA310)，乙酰唑胺原料藥(武漢遠城科技發展有限公司，純度≥98%)。異檸檬酸脫氫酶(NADP)、ATP、Coenzyme Q1、硫辛酰胺脫氫酶、NADP+等均購買于SIGMA公司。

1.1.4儀器：FLYDWC50-ⅡA小型低壓低氧動物實驗艙(中航工業貴州風雷航空軍械有限責任公司)；Spectramax i3型全自動酶標儀(美國MD公司)；TYSP-500A型高速多功能粉碎機(永康市紅太陽機電有限公司)；JD2000-2G型電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)；F-121104-7131超聲波清洗機；Sorvall Legend Micro 17離心機(Thermo)。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物分組與模型建立：將60只Balb/c雄性小鼠隨機分為6組，每組10只，灌胃給藥，木香70%乙醇提取物低、中、高劑量組分別給予木香70%乙醇提取物125、250、375 mg/kg，乙酰唑胺組給予腹腔注射300 mg/kg乙酰唑胺，給藥體積為20 ml/kg，正常對照組與缺氧模型組灌胃等體積生理鹽水，連續給藥5 d，末次給藥60 min后將小鼠放入低壓低氧動物實驗艙，以2 m/s的速率減壓模擬升高海拔至8000 m缺氧72 h，隨后以10 m/s速度降低海拔至當地海拔高度(1517 m)，取出小鼠，水合氯醛麻醉，處死后解剖，取肝組織。

1.2.2組織線粒體重懸液制備：小鼠肝臟組織稱重200 mg左右，加10倍量的分離緩沖液[6]，手動勻漿，1000×g離心2 min，吸取上清液，上清液10 000×g離心10 min，棄去上清液，沉淀加0.25 mmol/L蔗糖得線粒體重懸液。分裝，-80℃儲藏(測量線粒體膜電位的重懸液不可冷凍)。該過程需要在小鼠解剖2 h內完成。

1.2.3線粒體膜電位的測定:JC-10聚集在線粒體基質中，形成聚合物，可以產生紅色熒光，線粒體膜電位降低時，JC-10不能聚集在線粒體的基質中，此時的JC-10為單體，產生綠色熒光，所以JC-10從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以容易的檢測到細胞膜電位的下降。按說明書操作，使用熒光酶標儀測量，檢測JC-10單體激發波長490 nm，發射波長530 nm,檢測JC-10聚合物激發波長525 nm，發射波長590 nm。最后根據紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。

1.2.4線粒體順烏頭酸酶活性測定:使用熒光酶標儀測量[7]，激發波長340 nm，發射波長 466 nm，30℃ 掃描6～8 min。

1.2.5線粒體蘋果酸脫氫酶活性測定:使用熒光酶標儀測量[8]，激發波長340 nm，發射波長466 nm，30℃掃描25 min。

1.2.6線粒體α-酮戊二酸脫氫酶活性的測定:使用熒光酶標儀測量[9-10]，激發波長340 nm，發射波長466 nm，30℃掃描10 min。

1.2.7線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ(NADH脫氫酶)：測定方法參考文獻[11]，30℃孵育5 min，600 nm連續掃描2 min。

1.2.8線粒體呼吸鏈復合體Ⅱ(琥珀酸脫氫酶)：測定方法參考文獻[12]，30℃孵育5 min，600 nm，連續掃描2 min。

2 結果

2.1肝臟線粒體膜電位變化 與正常對照組比較，缺氧模型組線粒體膜電位顯著降低(P<0.01)；與缺氧模型組比較，木香70%乙醇提取物低、中、高劑量組線粒體膜電位顯著升高(P<0.01)。見圖1。

圖1 木香70%乙醇提取物對缺氧小鼠肝組織線粒體膜電位的影響

正常對照組與缺氧模型組灌胃等體積生理鹽水，乙酰唑胺組給予腹腔注射300 mg/kg乙酰唑胺，低、中、高劑量組分別給予木香70%乙醇提取物125、250、375 mg/kg；與正常對照組比較，bP<0.01；與缺氧模型組比較，dP<0.01

2.2肝臟線粒體順烏頭酸酶活性變化 缺氧模型組線粒體順烏頭酸酶活性與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；與缺氧模型組比較，木香70%乙醇提取物低、中、高劑量組線粒體順烏頭酸酶活性顯著升高(P<0.05，P<0.01)，隨著給藥劑量的增加，線粒體順烏頭酸酶活性升高，存在一定的劑量依賴性。見圖2。

圖2 木香70%乙醇提取物對缺氧小鼠肝組織線粒體順烏頭酸酶活性影響

正常對照組與缺氧模型組灌胃等體積生理鹽水，乙酰唑胺組給予腹腔注射300 mg/kg乙酰唑胺，低、中、高劑量組分別給予木香70%乙醇提取物125、250、375 mg/kg；與缺氧模型組比較，aP<0.05，bP<0.01

2.3肝臟線粒體蘋果酸脫氫酶活性變化 缺氧模型組線粒體蘋果酸脫氫酶活性與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；木香70%乙醇提取物高劑量組和乙酰唑胺組線粒體蘋果酸脫氫酶活性低于缺氧模型組(P<0.05)，但木香70%乙醇提取物低、中劑量組與缺氧模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。隨著給藥劑量的增加，線粒體蘋果酸脫氫酶活性降低，高劑量組低于低、中劑量組(P<0.05)。見圖3。

圖3 木香70%乙醇提取物對缺氧小鼠肝組織線粒體蘋果酸脫氫酶活性影響

正常對照組與缺氧模型組灌胃等體積生理鹽水，乙酰唑胺組給予腹腔注射300 mg/kg乙酰唑胺，低、中、高劑量組分別給予木香70%乙醇提取物125、250、375 mg/kg；與缺氧模型組比較，aP<0.05；與低劑量組比較，cP<0.05;與中劑量組比較，eP<0.05

2.4肝臟線粒體α-酮戊二酸脫氫酶活性變化 缺氧模型組肝臟線粒體α-酮戊二酸脫氫酶活性與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；木香70%乙醇提取物低、中、高劑量組線粒體α-酮戊二酸脫氫酶活性高于缺氧模型組(P<0.01)，隨著給藥劑量的增加，線粒體α-酮戊二酸脫氫酶活性升高，呈劑量依賴性。見圖4。

圖4 木香70%乙醇提取物對缺氧小鼠肝組織線粒體α-酮戊二酸脫氫酶活性影響

正常對照組與缺氧模型組灌胃等體積生理鹽水，乙酰唑胺組給予腹腔注射300 mg/kg乙酰唑胺，低、中、高劑量組分別給予木香70%乙醇提取物125、250、375 mg/kg；與缺氧模型組比較，bP<0.01

2.5肝臟線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ活性變化 缺氧模型組線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ活性低于正常對照組，乙酰唑胺組高于缺氧模型組(P<0.01)；與缺氧模型組比較，木香70%乙醇提取物高劑量組線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ活性顯著升高(P<0.01)，隨著給藥劑量的增加，線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ活性升高，且高劑量組高于低、中劑量組(P<0.05)。見圖5。

圖5 木香70%乙醇提取物對缺氧小鼠肝線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ活性影響

正常對照組與缺氧模型組灌胃等體積生理鹽水，乙酰唑胺組給予腹腔注射300 mg/kg乙酰唑胺，低、中、高劑量組分別給予木香70%乙醇提取物125、250、375 mg/kg；與正常對照組比較，bP<0.01；與缺氧模型組比較，dP<0.01；與低劑量組比較，aP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05

2.6肝臟線粒體呼吸鏈復合體Ⅱ活性變化 與正常對照組比較，缺氧模型組線粒體呼吸鏈復合體Ⅱ活性顯著降低(P<0.01)；與缺氧模型組比較，木香70%乙醇提取物低、中、高劑量組線粒體呼吸鏈復合體Ⅱ活性顯著升高(P<0.05，P<0.01)。見圖6。

圖6 木香70%乙醇提取物對缺氧小鼠肝線粒體呼吸鏈復合體Ⅱ活性影響

正常對照組與缺氧模型組灌胃等體積生理鹽水，乙酰唑胺組給予腹腔注射300 mg/kg乙酰唑胺，低、中、高劑量組分別給予木香70%乙醇提取物125、250、375 mg/kg；與正常對照組比較，bP<0.05；與缺氧模型組比較，aP<0.05，dP<0.01

3 討論

線粒體與維持細胞正常功能密切相關，正常的線粒體膜電位是維持線粒體氧化磷酸化、產生三磷酸腺苷的先決條件，膜電位的穩定有利于維持細胞的正常生理功能。隨著線粒體膜電位降低，造成線粒體通透性轉換孔的開放，該通道的開放被認為是線粒體和細胞凋亡的原因[13]。本研究結果顯示，木香70%乙醇提取物低、中、高劑量組線粒體膜電位高于缺氧模型組，提示木香70%乙醇提取物可以顯著提高由于缺氧造成的小鼠肝臟線粒體膜電位。

三羧酸循環和糖酵解是提供能量的主要途徑，順烏頭酸酶、α-酮戊二酸脫氫酶作為三羧酸循環的關鍵酶，蘋果酸脫氫酶是糖酵解途徑的關鍵酶，木香70%乙醇提取物能維持缺氧狀態下順烏頭酸酶、α-酮戊二酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶的活性，同時能夠維持線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ的活性。本研究結果顯示，木香70%乙醇提取物低、中、高劑量組線粒體順烏頭酸酶、α-酮戊二酸脫氫酶活性和呼吸鏈復合體Ⅱ活性高于缺氧模型組，高劑量組線粒體蘋果酸脫氫酶活性低于缺氧模型組，線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ活性高于缺氧模型組，提示木香70%乙醇提取物對缺氧小鼠肝臟線粒體具有保護作用。

目前國內外治療高原病的藥物主要是碳酸酐酶抑制劑或甲羥孕酮及糖皮質激素類藥物[14]，但是由于其存在較大不良反應，作為預防高原病的藥物并不理想。從傳統中藥中尋找不良反應小療效確切的候選藥物是目前抗高原缺氧防治藥物研發的熱點。木香為國內外常用藥材，在我國始載于《神農本草經》，有行氣止痛、溫中和胃之功效，用于胸腹、脹痛、嘔吐、腹瀉、痢疾、里急后重、食積不消等癥[15]。國內外對其研究主要集中在消化和生殖系統方面，該實驗為國內外首次對木香的抗高原缺氧相關作用進行研究，從而為開發木香新的藥用途徑提供了實驗基礎。