WISP-3/CNN6與Caspase-8共結合在高氧誘導肺上皮細胞凋亡中的作用及其機制

黃曉梅　王康瑋　唐萬娜　趙祝香　趙子文　魏樹全

【摘要】目的 探討Wnt-1誘導信號通路蛋白3/調節蛋白6（WISP-3/CNN6）與半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）共結合在高氧誘導肺上皮細胞凋亡中的作用與可能機制。方法 利用小干擾RNA和質粒轉染實現對人肺上皮Beas-2B細胞中WISP-3/CCN6基因的沉默或過表達，分別將低表達或過表達WISP-3/CCN6的Beas-2B細胞置高氧（95%O2和5%CO2）或空氣中處理0、24、48 h，通過蛋白免疫印跡法和流式細胞儀檢測各組細胞中Caspase途徑凋亡相關蛋白Caspase-8、Caspase-3及活性片段cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3和cleaved 多聚ADP核糖聚合酶（PARP）的表達量及Caspase-8活性，通過免疫共聚焦和免疫共沉淀檢測WISP-3/CCN6與Caspase-8的蛋白相互作用。結果 高氧刺激48 h，WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細胞中cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3和cleaved PARP蛋白表達量均比0 h時增加（P均< 0.017），且Caspase-8的活性增高（P < 0.05）;過表達WISP-3/CCN6的Beas-2B細胞中cleaved Caspase-8蛋白表達量比0 h時減少（P < 0.017），cleaved Caspase-3和cleaved PARP的蛋白表達量在24 h時比0 h時升高、在48 h時比24 h時下降（P均< 0.017）。高氧刺激下，Beas-2B細胞中WISP-3/CCN6蛋白和Caspase-8蛋白結合減少。結論 WISP-3/CCN6通過Caspase途徑參與高氧誘導肺上皮細胞凋亡的調控，其作用可能通過與Caspase-8蛋白結合方式實現。

【關鍵詞】高氧;細胞凋亡;Wnt-1誘導信號通路蛋白3/調節蛋白6;半胱氨酸蛋白酶途徑;急性肺損傷

【Abstract】Objective To investigate the role and the molecular mechanism of WISP-3/CCN6 binding with Caspase-8 in the hyperoxia-induced apoptosis of the lung epithelial cells. Methods The silencing and overexpression of WISP-3/CCN6 in the human lung bronchial epithelial cells （Beas-2B） were performed by plasmid transfection and siRNA. The Beas-2B cells with silencing or overexpressing WISP-3/CCN6 were maintained in hyperoxia （95%O2 and 5%CO2） or air for 0， 24 and 48 h， respectively. The expression levels of key proteins of Caspase signaling pathway （Caspase-8， Caspase-3， cleaved Caspase-8， cleaved Caspase-3 and PARP） were detected with Western blot and the activity of Caspase-8 was determined with flow cytometry. The protein interaction between WISP-3/CCN6 and Caspase-8 was analyzed by immunoconfocal and immunocoprecipitation. Results After 48-h hyperoxia treatment， the expression levels of cleaved Caspase-8， cleaved Caspase-3 and cleaved PARP in the Beas-2B cells with silencing WISP-3/CCN6 were significantly up-regulated （all P < 0.017） and the activity of Caspase-8 was remarkably increased compared with those at 0 h （P < 0.05）. The expression of cleaved Caspase-8 in the Beas-2B cells with overexpressing WISP-3/CCN6 was significantly down-regulated than that at 0 h （P < 0.017）. The expression levels of cleaved Caspase-3 and cleaved PARP at 24 h were significantly up-regulated than those at 0 h， whereas the expression levels at 48 h were significantly down-regulated compared with those at 24 h （all P < 0.017）. The protein interaction between WISP-3/CCN6 and Caspase-8 was signigficantly decreased in the Beas-2B cells after hyperoxia. Conclusion WISP-3/CCN6 participates in the regulation of hyperoxia-induced apoptosis of lung epithelial cells via the Caspase signaling pathway， probably by binding with Caspase-8 protein.

【Key words】Hyperoxia;Cell apoptosis;WISP-3/CCN6;Caspase pathway;Acute lung injury

高濃度氧療對危重癥患者的危害已經引起了國內外呼吸危重癥領域的關注，但國內相關研究仍然較少。筆者前期研究發現高氧可以引起肺上皮細胞凋亡[1]。有研究顯示，Wnt-1誘導信號通路蛋白3/調節蛋白6（WISP-3/CCN6）作為一種信號傳導因子在高氧誘導的肺上皮細胞凋亡中具有保護性作用，但其機制仍然不清楚。本文將在前期研究的基礎上進一步探究WISP-3/CCN6在高氧誘導肺上皮細胞凋亡中的作用機制，為未來防治高氧性肺損傷提供基礎依據。

材料與方法

一、細胞培養

人肺上皮細胞株（Beas-2B細胞）購自美國標準生物品收藏中心（ATCC）。細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養液，置于37℃含5%CO2細胞培養箱中進行培養。

二、高氧模型的建立

參考本課題組前期研究建立高氧模型[2-3]。

三、WISP-3/CCN6質粒及siRNA轉染

通過質粒轉染和小干擾RNA（siRNA）技術實現對Beas-2B細胞中WISP-3/CCN6基因的過表達及沉默，選用Lipofectamine 2000轉染試劑盒，購自美國Invitrogen公司，詳細步驟參考試劑盒說明書。

四、蛋白免疫印跡檢測

分別把沉默或過表達WISP-3/CCN6基因的Beas-2B細胞置于高氧中培養0、24、48 h，以空氣環境為對照（control）。提取各組細胞蛋白，蛋白免疫印跡法檢測半胱氨酸蛋白酶（Caspase）途徑凋亡相關蛋白Caspase-8、Caspase-3和活化片段cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3以及cleaved-多聚ADP核糖聚合酶（PARP）表達量。WISP-3/CCN6、β-actin抗體購自美國Sigma公司。采用Image J軟件對結果進行灰度分析。

五、流式細胞儀檢測Caspase-8蛋白活性

采用美國BD公司的Caspase-8蛋白活性檢測試劑盒和BD公司的流式細胞儀檢測空氣環境及高氧刺激0、48 h時WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細胞中Caspase-8的活性。

六、免疫熒光-激光共聚焦試驗

為了進一步驗證WISP-3/CCN6在高氧刺激肺上皮細胞的作用方式，利用免疫熒光-激光共聚焦和免疫共沉淀法檢測WISP-3/CCN6蛋白與細胞內凋亡關鍵蛋白的結合變化。其中免疫熒光-激光共聚焦采用美國Sigma公司的抗WISP-3/CCN6抗體、美國Santa Cruz公司的抗Caspase-8抗體和德國Leica公司的激光掃描共聚焦顯微鏡進行檢測。步驟為：①24孔板中放置圓形玻片，將Beas-2B細胞接種于玻片上;②放入37℃、5%CO2培養箱中培養到細胞密度約50% ～ 60%，把細胞分別置于高氧（95%O2和5%CO2）和空氣中處理24 h;

③用鑷子輕輕取出玻片置于操作臺上，趁玻片未干時向玻片滴入磷酸鹽緩沖液（PBS），然后負壓吸干，洗滌3次;④在玻璃片上滴入4%多聚甲醛，固定30 min后，負壓吸干，固定細胞;⑤滴入0.5% Triton-X-100覆蓋整個玻片，室溫放置1 h（細胞膜打孔）;⑥然后用PBS洗滌3次，滴入5%牛血清白蛋白，室溫放置2 h;⑦把玻片放回24孔板，加入1∶100的一抗（Caspase-8抗體和WISP-3/CCN6抗體）4 ℃過夜孵育;⑧次日取出，用PBS洗滌3次后加入熒光抗體（紅色為Caspase-8抗體，綠色為WISP-3/CCN6抗體），避光孵育10 min;⑨取出玻片，自然晾干后倒扣于載玻片上，周圍用指甲油封邊。最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察空氣環境和高氧環境下Caspase-8與WISP-3/CCN6的結合情況。

七、免疫共沉淀試驗

采用美國Abcam公司的細胞裂解液RIPA緩沖液、美國Sigma公司的抗WISP-3/CCN6抗體進行檢測。步驟為：①把Beas-2B細胞接種于6孔板，放入37℃、5%CO2培養箱中培養到細胞密度約50% ～ 60%，把細胞分別置于高氧（95%O2和5%CO2）、空氣中處理4 h;②取出細胞置于冰上，用預冷的PBS溶液洗滌細胞2次后，加入細胞裂解液RIPA buffer（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min;③4℃，18 000轉/分離心30 min后，把上清液轉移到新的EP管，取少量樣品以備蛋白免疫印跡分析;④在樣品中加入1 μl的興趣蛋白抗體，4℃搖床緩慢搖晃孵育過夜;⑤次日取10 μl的Protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3000轉/分離心3 min;⑥將預處理過的10 μl

的Protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的樣品中，4℃搖床緩慢搖晃孵育2 ～ 4 h，使抗體與protein A瓊脂糖珠充分偶聯;⑦4℃，3000轉/分

離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底，將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 ml裂解緩沖液洗滌3 ～ 4次，洗滌時用手指輕彈;⑧最后加入15 μl的2倍SDS 上樣緩沖液，沸水煮5 min，免疫印跡檢測目的蛋白。本研究的興趣蛋白為WISP-3/CCN6，目的蛋白為Caspase-8。

八、統計學處理

采用SPSS 22.0分析結果，計量資料采用表示，組間比較采用方差分析，P < 0.05為差異有統計學意義，兩兩比較采用Bonferroni法，即P < 0.05/3 = 0.017為差異有統計學意義。

結果

一、環境對WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細胞中Caspase途徑凋亡相關蛋白的影響

無論是高氧刺激還是空氣環境下，WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細胞中Caspase-8、Caspase-3蛋白表達量均無明顯變化（P均> 0.05）。空氣環境下，WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細胞中cleaved Caspase-8和cleaved Caspase-3蛋白表達量均無變化（P均> 0.05）。高氧刺激下，WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細胞中cleaved Caspase-8蛋白表達量在24 h和48 h升高（總體比較F = 13.590、P = 0.006，與0 h比較P均< 0.017），cleaved Caspase-3僅在48 h表達上調（總體比較F = 86.24、 P < 0.001，與0 h和24 h比較P均< 0.017）。WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細胞中cleaved PARP表達量在高氧刺激（F = 728.90，P < 0.001）及空氣環境（F = 39.19，P < 0.001）24 h和48 h均升高（與0 h比較，P均< 0.017），高氧刺激下cleaved PARP表達量在WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細胞中升高趨勢較空氣環境更明顯（與24 h比較，P < 0.017），見圖1A ～ C。高氧刺激48 h下，WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細胞中的Caspase-8活性比0 h時升高，見圖1D。

二、環境對WISP-3/CCN6過表達的Beas-2B細胞中Caspase途徑凋亡相關蛋白的影響

無論是高氧刺激還是空氣環境下，WISP-3/CCN6過表達的Beas-2B細胞中Caspase-8、Caspase-3蛋白表達量均無明顯變化（P均> 0.05）?？諝猸h境下，WISP-3/CCN6過表達的Beas-2B細胞中cleaved Caspase-3蛋白表達量在48 h時升高（總體比較F = 202.55、 P < 0.001，與0 h和24 h比較P均< 0.017，cleaved PARP蛋白表達量隨時間延長而升高（總體比較F = 155.53、P < 0.001，3個時間點兩兩比較P均<0.017）。高氧刺激下，WISP-3/CCN6過表達的Beas-2B細胞中cleaved Caspase-8隨時間延長而均減少（總體比較F = 21.79、P = 0.002，3個時間點兩兩比較P均< 0.017），cleaved Caspase-3 （F = 105.10，P < 0.001）和cleaved PARP（F = 320.00，P < 0.001）蛋白表達量在24 h比0 h升高，48 h時均下降（3個時間點兩兩比較P均< 0.017），見圖2。

三、環境對肺上皮細胞中WISP-3/CCN6和Caspase-8蛋白的相互作用影響

與空氣環境相比，高氧刺激24 h時Beas-2B細胞WISP-3/CCN6與細胞內凋亡關鍵蛋白Caspase-8結合的熒光信號減少（圖3A）。把WISP-3/CCN6作為感興趣蛋白，與空氣環境相比，高氧刺激24 h時與其結合的Caspase-8蛋白減少（P < 0.001，圖3B）。

討論

高氧誘導肺上皮細胞凋亡的機制是異常復雜的，其確切的機制仍然不清楚。在凋亡通路中，Caspase家族發揮重要的作用。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡效應因子，控制下游的凋亡共同通路，它的活化標志著凋亡進入不可逆的階段，因此Caspase-3及其活性片段也被稱為凋亡的生物標志物[4]。

本研究中，肺上皮細胞中WISP-3/CCN6沉默后再接受高氧刺激48 h，細胞的cleaved Caspase-3活性片段表達增加，表明沉默WISP-3/CCN6可以促進Caspase-3的激活。Caspase-3是凋亡外源性和內源性途徑的共同效應蛋白，它的激活可以進一步活化下游的凋亡因子，如PARP[5-7]。多種凋亡刺激因子可以啟動Caspase-3活化，Caspase-3蛋白酶原被切割成有活性的片段cleaved Caspase-3，活化的Caspase-3又進一步作用于下游的不同底物，導致蛋白酶級聯反應，最終引起細胞凋亡。為了進一步驗證WISP-3/CCN6與Caspase-3的關系，本研究在Beas-2B細胞中過表達WISP-3/CCN6，與

0 h時相比，過表達WISP-3/CCN6的細胞在高氧刺激下，Caspase-3蛋白表達量無明顯變化，cleaved Caspase-3的蛋白表達量先升高，后下降。因此，WISP-3/CCN6可能控制著Caspase-3的活化，進而調控高氧誘導的肺上皮細胞凋亡。

要驗證WISP-3/CCN6通過Caspase-3調控細胞凋亡，仍需要進一步驗證WISP-3/CCN6與其下游凋亡效應因子的關系。本研究中Beas-2B細胞沉默和過表達WISP-3/CCN6基因后再接受高氧刺激48 h，結果顯示沉默WISP-3/CCN6的肺上皮細胞中 cleaved PARP蛋白表達量增加，而WISP-3/CCN6過表達的肺上皮細胞中的cleaved PARP蛋白表達量先升高，后隨時間延長下降，也就是說，WISP-3/CCN6可能影響著PARP的活化。WISP-3/CCN6對肺上皮細胞中Caspase-3和PARP活化的影響是同向的。那么在Caspase-3上游，凋亡啟動蛋白是否也與WISP-3/CCN6有聯系呢？

Caspase-3和Caspase-8同屬于Caspase家族，在細胞凋亡的外源性途徑中，Caspase-8是關鍵的啟動型蛋白，Caspase-8通過誘導接近模式活化后可以作用于底物Caspase-3引起下游的級聯反應引起凋亡。在正常情況下，Caspase-8存在于胞漿中，當細胞接受死亡刺激之后，Caspase-8可以與FADD結合，從而與細胞膜上的死亡受體發生間接結合，形成死亡誘導復合體，從而把死亡信號從細胞膜轉化到細胞漿中去[8-9]。本研究在Beas-2B細胞中沉默和過表達WISP-3/CCN6后再接受高氧刺激24、48 h，結果發現與0 h時相比，沉默WISP-3/CCN6的肺上皮細胞中cleaved Caspase-8蛋白表達量增加，而WISP-3/CCN6過表達的肺上皮細胞中的cleaved Caspase-8蛋白表達量降低，也就是說，WISP-3/CCN6也可能影響著Caspase-8的活化。進一步研究顯示，沉默WISP-3/CCN6的肺上皮細胞在高氧刺激48 h時Caspase-8的活性增強，證實WISP-5/CCN6與Caspase-8活化有關。

在高氧誘導肺上皮細胞模型當中，WISP-3/CCN6與凋亡效應蛋白Caspase-3以及其上游的凋亡啟動蛋白Caspase-8和下游的凋亡效應蛋白PARP均有聯系。由此推測，WISP-3/CCN6可能通過Caspase通路參與了高氧誘導的肺上皮細胞凋亡。那么WISP-3/CCN6的作用靶點在哪里？根據Caspase凋亡通路的原理，推測其作用靶點在Caspase-8或其上游。為此，本研究通過蛋白的相互作用了解WISP-3/CCN6與Caspase-8的關系。目前檢測蛋白間的相互作用常用的方法是免疫共聚焦和免疫共沉淀。該研究采用的細胞仍然是Beas-2B細胞。高氧處理24 h后，經細胞打孔和免疫熒光染色，并通過共聚焦顯微鏡觀察。結果顯示，與空氣環境相比，高氧刺激24 h后，WISP-3/CCN6和Caspase-8的蛋白結合熒光信號減少。同時，我們把WISP-3/CCN6設為興趣蛋白，用免疫共沉淀的方法把WISP-3/CCN6及其相結合的蛋白沉淀，進一步用蛋白免疫印跡法檢測WISP-3/CCN6與Caspase-8的關系。結果發現，與空氣環境相比，高氧刺激使WISP-3/CCN6和Caspase-8的蛋白結合減少。這兩項試驗的結果表明，高氧環境中，肺上皮細胞中的WISP-3/CCN6蛋白可能通過某種機制大量丟失，其丟失導致WISP-3/CCN6與Caspase-8的蛋白結合減少，進而導致Caspase-8激活，Caspase-8的活化引起其下游的一系列凋亡因子級聯激活，啟動經典的Caspase凋亡途徑，使肺上皮細胞大量凋亡。

綜上所述，WISP-3/CCN6可能是高氧誘導肺上皮細胞凋亡的一個重要調控蛋白，也可能是防治高氧性肺損傷的一個潛在的作用靶點，值得進一步研究。然而高氧誘導肺上皮細胞凋亡的機制是異常復雜的，WISP-3/CCN6僅為其中的一個關鍵蛋白，是否存在其他的機制仍有待進一步研究。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2019-12-19）

（本文編輯：林燕薇）