姜黃素及其類似物抑制CCl4誘導大鼠肝纖維化的作用及機制研究

王子愷 毛泳彬 孔力

[摘要] 目的 研究姜黃素及其類似物抑制CCl4誘導大鼠肝纖維化的作用及機制。 方法 SD大鼠雄性40只，按體重隨機分成模型組，對照組，姜黃素組，H8低、高劑量組，每組8只。模型組，姜黃素組和H8組腹腔注射40%CCl4橄欖油復制肝纖維化模型，8周后姜黃素組，H8低、高劑量組給予相應藥物灌胃，同時每周腹腔注射40%CCl4橄欖油一次，共4周。處死大鼠后，檢測血液生化指標，肝組織HE和Masson染色觀察病理形態學變化，QPCR測Col1、纖連蛋白（FN）、轉化生長因子-β（TGF-β）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）mRNA。 結果 模型組谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、血清谷氨酰轉肽酶（GGT）、肝臟系數、Col1、FN、TGF-β、α-SMA mRNA顯著高于對照組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。姜黃素組，H8低、高劑量組血清ALT、AST、GGT、肝臟系數、Col1、FN、TGF-β、α-SMA mRNA顯著低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 姜黃素及其類似物H8對CCl4誘導的肝纖維化大鼠有保護作用，且H8作用優于姜黃素。

[關鍵詞] 姜黃素及其類似物;四氯化碳;肝纖維化;肝臟系數;病理形態學

[中圖分類號] R575.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）03（b）-0013-04

[Abstract] Objective To study the effect and mechanism of curcumin and its analogues on CCl4 induced hepatic fibrosis in rats. Methods Forty male Wistar rats were randomly divided into model， normal curcumin， H8 low and high dose groups， with 8 rats in each group according to body weight. The model group， curcumin group and H8 group were intraperitoneally injected with 40% CCl4 olive oil to replicate the liver fibrosis model. After 8 weeks， the curcumin group， H8 low and high dose groups were given the corresponding drugs by gavage， and intraperitoneal injection of 40% CCl4 olive oil once for 4 weeks. After sacrificed the rats， blood biochemical indicators were measured， pathological morphological changes were observed by HE and Masson staining of liver tissue， while Col1， fibronectin （FN）， transforming growth factor-β （TGF-β）， and α-smooth muscle actin （Α-SMA） mRNA were measured by QPCR. Results The alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， serum glutamyl transpeptidase （GGT）， liver coefficient， Col1， FN， TGF-β， α-SMA mRNA in the model group were significantly higher than those in the control group， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. In the curcumin group， the serum ALT， AST， GGT， liver coefficient， Col1， FN， TGF-β， and α-SMA mRNA in the H8 low and high-dose groups were significantly lower than those in the model group， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Curcumin and its analogue H8 have therapeutic and protective effects on CCl4 induced liver fibrosis in rats， and H8 has better effects than curcumin.

[Key words] Curcumin and its analogues; Carbon tetrachloride; Liver fibrosis; Liver coefficient; Pathomorphology

姜黃素（Curcumin）具有抗炎、抗癌、抗肝纖維化等藥理作用[1-3]，抗癌作用已二期臨床[4-5]。但姜黃素溶解度差，血藥濃度低，限制了應用[6]。課題組以姜黃素為母體進行結構修飾，合成穩定的姜黃素類似物[7-8]。本文探討H8對CCl4誘導大鼠肝纖維化的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

實驗動物及飼養SD大鼠[遼寧長生生物，SCXK（遼）2015-0001，合格號：211002300036102]，雄性，體重300～400 g。于18～24℃、濕度50%～70%、12 h交替照明環境下，自由飲食。本研究經牡丹江醫學院動物倫理委員會批準。

主要試劑與儀器H8（牡丹江醫學院設計）;RNA逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen，貨號：11904018）;伊紅、蘇木精（北京索萊寶科技）;Col1（GR3265108-1）、FN（GR3274504-1）、TGF-β（GR 3203762-3）、α-SMA（GR 3263275-5）抗體均購于美國Abcam;激光共聚焦顯微鏡（FV1000日本Olympus）;凝膠成像分析系統（FluorChem M美國）;熒光定量PCR儀（StepOne美國ABI）。

1.2 方法

SD大鼠40只，按體重隨機分為模型組、對照組、姜黃素組（姜黃素5 mg/kg），H8低、高劑量組（H8 5、10 mg/kg）。對照組腹腔注射1.2 mL/kg橄欖油，2次/周×8周;其余4組按2 mL/kg的40%CCl4橄欖油腹腔注射，2次/周×8周。治療組用1%CMC溶解姜黃素（5 mg/kg），H8（5、10 mg/kg），1次/d×28 d，模型組和對照組給予空白溶劑灌胃。

1.3 標本采集測定

12周后，禁食24 h，乙醚麻醉后處死大鼠。心臟取血，37℃孵育30 min，3000 × g離心15 min，生化分析儀測定谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、血清中谷氨酰轉肽酶（GGT）。肝臟重量除于體重得肝臟系數。部分肝組織用4%甲醛固定，其他放入-80℃冰箱中。

1.4 病理學檢測

HE染色觀察病理變化，Masson染色觀察纖維化變化。HE染色：取甲醛固定的肝組織，石蠟包埋，切片5 μm，烘干、二甲苯，梯度酒精脫水，伊紅-蘇木精染色，在顯微鏡下觀察大鼠肝組織病理變化。Masson染色：同上切片，Masson試劑盒染色，在顯微鏡下觀察肝組織纖維化。

1.5 肝組織中纖維化相關基因mRNA表達檢測

RNA提取試劑盒提取肝組織總RNA，逆轉錄成cDNA。取2 μL cDNA，9 μL SYBR Green Mix，分別加Col1、纖連蛋白（FN）、轉化生長因子-β（TGF-β）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、內參RPS16上下游引物各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。QPCR反應條件：95℃預變性5 min;94℃變性30 s，55～60℃退火30 s，40個循環，重復2個復孔，測Ct值，標準曲線法計算基因相對表達。引物：Col1正義3′-ACAGGCGAACAAGGTGACAGAG-5′，反義3′-GCCAGGAGAACCAGCAGA-GC-5′;TGF-β正義3′-CAACAATTCCTGGCGTTACCTTG-5′，反義3′-CGAAAGCCCTGTATTCCGTCTCC-5′;α-SMA正義3′-CACCATCGGGAATGAACGCTTC-5′，反義3′-CTGTCAGCAATGCCTGGGTA-5′;FN正義3′-GCCTGAACCAGCCTACGGAT-5′，反義ATGACC-ACTGCCAAAGCCCAAG-5′;RPS16正義3′-CGTG-CTTGTGCTCGGAGCTA-5′，反義3′-GCTCCTTGCCC-AGAAGCAAA-5′。

1.6 統計學方法

采用Graph Pad Prism 5.0對所得數據進行統計分析。計量資料以均值±標準差（x±s）表示，多組間采用One-way AVONA單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢查。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清ALT、AST和GGT及肝臟系數比較

模型組血清ALT、AST和GGT顯著高于對照組;姜黃素組，H8低、高劑量組血清ALT、AST和GGT水平顯著低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。模型組肝臟系數顯著高于對照組;姜黃素組，H8低、高劑量組肝臟系數顯著低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表1。

2.2 肝臟組織病理學檢測結果

與對照組比較，模型組肝索結構紊亂，肝小葉排列不規則，肝竇高度擴增，間質內有炎性浸潤。與模型組比較，姜黃素組，H8低、高劑量組肝索排列規則，肝小葉結構較清晰，肝竇變窄，鮮見肝細胞變性和炎性浸潤。HE染色見圖1。

與對照組比較，模型組肝組織出現廣泛纖維化。與模型組比較，姜黃素組大鼠纖維化減輕，H8低、高劑量組纖維化降低更明顯。Masson染色見圖2。

2.3 H8對大鼠肝纖維化基因的影響

模型組Col1、TGF-β、α-SMA、FN表達顯著高于對照組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;姜黃素組，H8低、高劑量Col1、TGF-β、α-SMA、FN表達顯著低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖3。

3 討論

CCl4是經典肝纖維化模型的誘導劑，被機體吸收后被細胞色素氧化酶P450激活為CCl3和Cl自由基[9]，與生物大分子結合，肝細胞壞死和膠原沉積，導致肝纖維化[10]，可作為肝纖維化模型[11]。文獻報道，肝纖維化動物血清中肝臟系數、ALT、AST、GGT增加[12-13]，并且Col1、TGF-β、α-SMA、FN表達增多[14-15]。本實驗在CCl4造模后，指標與相關文獻一致。經過治療這些指標均降低，提示姜黃素及H8能改善CCl4所致大鼠肝臟纖維化，其中H8效果更明顯，具有應用前景[8]。

肝纖維化是復雜的病理生理過程，其特征為細胞外基質（ECM）增多，肝臟結構破壞，肝功能下降[16]。正常肝星狀細胞（HSCs）維持靜止表型[17]，隨著HSC活化和增殖，增加ECM相關蛋白α-SMA、Col1[18]。TGF-β/Smads信號通路激活，加快ECM生成與沉積[19-20]。本實驗模型組Col1、TGF-β、α-SMA、FN增高，經治療后又被抑制，結果與相關文獻一致[15]。

綜上，姜黃素及其類似物H8可抑制CCl4誘導的大鼠肝纖維化，機制與減少ECM相關蛋白有關，為開發保護肝臟纖維化的藥物奠定基礎。

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（收稿日期：2019-08-28? 本文編輯：王曉曄）