注射用鹽酸溴己新原料中細菌內(nèi)毒素的檢測

林金海 陳曉佳 丁友玲

摘 要 目的：建立注射用鹽酸溴己新原料中細菌內(nèi)毒素的檢測方法。方法：對鹽酸溴己新原料預處理后再進行細菌內(nèi)毒素檢測，并依據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版細菌內(nèi)毒素檢查法中的干擾實驗對預處理方法進行驗證。結(jié)果：預處理并稀釋160倍后的鹽酸溴己新原料對鱟試劑（λ=0.06 EU/ml）無干擾作用。結(jié)論：所建立的注射用鹽酸溴己新原料中細菌內(nèi)毒素檢測方法是可行的。

關鍵詞 細菌內(nèi)毒素 鹽酸溴己新 干擾實驗

中圖分類號：R927.12； R974.1 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2020）07-0075-03

Study on the bacterial endotoxin test in the raw material of bromhexine hydrochloride for injection*

LIN Jinhai， CHEN Xiaojia， DING Youling**

（Fuzhou Xinbei Biochemical Industrial Co.， Ltd.， Fuzhou 350101， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the bacterial endotoxin test in the raw material of bromhexine hydrochloride for injection. Methods： The raw material of bromhexine hydrochloride for injection was pretreated and then bacterial endotoxin test was performed. The method was verified based on the interference experiment in the bacterial endotoxin test section of Chinese Pharmacopoeia 2015 Edition. Results： There was no interference on tachypleus amebocyte lysate （λ=0.06 EU/ml）after it was pretreated and diluted by 160 times. Conclusion： The established method can be used for the bacterial endotoxin test in the raw material of bromhexine hydrochloride for injection.

KEy WORDS bacterial endotoxin； bromhexine hydrochloride； interference experiment

細菌內(nèi)毒素檢查法要求實驗樣品溶液pH控制在6～8[1]。鹽酸溴己新（bromhexine hydrochloride）在乙醇中微溶，在水中極微溶解[2]。乙醇助溶后的鹽酸溴己新溶液（1 mg/ml）pH<4，為了檢測鹽酸溴己新原料中的細菌內(nèi)毒素，筆者采用加堿性調(diào)節(jié)劑（pH=7.8的TrisHCl緩沖溶液）調(diào)節(jié)pH至7.5左右，再稀釋至160倍，使之適用于細菌內(nèi)毒素檢查法。根據(jù)《中華人民共和國藥典》四部通則“1143細菌內(nèi)毒素檢查法”中“干擾實驗”的要求，對本預處理進行了驗證。

1 材料及儀器

1.1 材料和試劑

鱟試劑（TAL）（批號：18051312，規(guī)格：0.1 ml/支，標示靈敏度：0.06 EU/ml），細菌內(nèi)毒素檢查用水（批號：18033121，規(guī)格：100 ml/瓶），pH調(diào)節(jié)劑（堿性）（批號：180301，pH為7.8～8.2，規(guī)格：2 ml/支），以上試劑均為福州新北生化工業(yè)有限公司生產(chǎn)。

細菌內(nèi)毒素國家標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：150800-201601，規(guī)格：1 ml/支，效價：9 000 EU/支）。無水乙醇（西隴科學股份有限公司，批號：17120102，分析純）。注射用鹽酸溴己新原料（江西億友藥業(yè)有限公司，細菌內(nèi)毒素限值<10 EU/mg）。

1.2 儀器

FA2204B電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；XMTD-7000電熱恒溫水溫箱（上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司）；ZH-2混合器（天津藥典標準儀器廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 預實驗

2.1.1 鱟試劑靈敏度（λ）的復核

依照《中華人民共和國藥典》四部通則1143“細菌內(nèi)毒素檢查法”，對選用的鱟試劑進行靈敏度復核試驗，實測靈敏度（λc）=antilg（∑X/4），式中X為反應終點濃度的對數(shù)值（lg），結(jié)果見表1。

由表1可見，鱟試劑（批號：18051312）的實測靈敏度（λc）為0.06 EU/ml，符合在0.5～2λ范圍內(nèi)的要求。

2.1.2 鹽酸溴己新原料預處理

鹽酸溴己新原料于100～105 ℃[3]下干燥5 h，取出置干燥器中降溫30 min，獲得鹽酸溴己新原料干燥品。精密稱定鹽酸溴己新原料干燥品，加無水乙醇溶解，在漩渦混合器中混合9 min，制成1 mg/ml的鹽酸溴己新溶液，即為供試品原液，備用。

2.1.3 鹽酸溴己新溶液干擾預實驗

供試品陰性對照（NPC）：供試品原液加等體積細菌內(nèi)毒素檢查用水，稀釋至2倍，再加入等體積的堿性調(diào)節(jié)劑（pH=7.8的Tris-HCl緩沖溶液），稀釋至4倍。用細菌內(nèi)毒素檢查用水進一步稀釋，制成稀釋20倍、40倍、80倍、160倍、320倍這5個連續(xù)稀釋倍數(shù)的溶液，作為NPC。

供試品陽性對照（PPC）：在上述5個NPC中加入細菌內(nèi)毒素標準溶液，使每個均含有2λ的細菌內(nèi)毒素，作為PPC。

陽性對照（PC）：細菌內(nèi)毒素濃度為0.125 EU/ml的細菌內(nèi)毒素檢查用水。

陰性對照（NC）：細菌內(nèi)毒素檢查用水。

選用鱟試劑（批號：18051312，λ=0.06 EU/ml）進

行干擾預實驗，結(jié)果見表2。

由表2可見，1 mg/ml的鹽酸溴己新溶液稀釋≥80倍時，對細菌內(nèi)毒素檢查實驗無干擾。為了有效避免干擾，本研究選用供試品原液稀釋160倍進行干擾實驗。

2.2 鹽酸溴己新溶液干擾實驗

取供試品原液（1 mg/ml）按干擾預實驗處理方法稀釋160倍，選用鱟試劑（批號18051312，λ=0.06 EU/ml），依據(jù)《中華人民共和國藥典》四部通則“1143細菌內(nèi)毒素檢查法”進行干擾實驗，結(jié)果見表3。

由表3可見，Es/Et在0.5～2.0間，表明1 mg/ml鹽酸溴己新乙醇溶液按預實驗處理（稀釋160倍）對鱟試劑（λ=0.06 EU/ml）無干擾作用。

2.3 注射用鹽酸溴己新原料的細菌內(nèi)毒素檢查

1 mg/ml的鹽酸溴己新乙醇溶液調(diào)節(jié)pH后，用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋160倍。按照《中華人民共和國藥典》四部通則1143“細菌內(nèi)毒素檢查法”進行細菌內(nèi)毒素檢查（鱟試劑λ=0.06 EU/ml）。實驗結(jié)果為：陽性對照、供試品陽性對照均為陽性；陰性對照、供試品陰性對照均為陰性。說明該批次注射用鹽酸溴己新原料（細菌內(nèi)毒素限值<10 EU/mg）稀釋160倍，選用鱟試劑（λ=0.06 EU/ml）進行細菌內(nèi)毒素檢查，原料細菌內(nèi)毒素含量符合要求。

3 結(jié)論

《中華人民共和國藥典》中“細菌內(nèi)毒素檢查法”代替兔法已應用于500多種藥品或原料藥細菌內(nèi)毒素的檢測。但是，對某些注射用藥品及原料在進行細菌內(nèi)毒素檢查時，需要排除干擾因素，以適應用鱟試劑檢測細菌內(nèi)毒素時所需的基本條件[4]。往往在樣品檢測前需加入二價陽離子調(diào)節(jié)劑、堿性或酸性調(diào)節(jié)劑，或者采用稀釋法來消除樣品對鱟試劑的干擾[5-9]。由于注射用鹽酸溴己新原料是難溶物質(zhì)，本研究采用乙醇溶解鹽酸溴己新原料，再加堿性調(diào)節(jié)劑（pH=7.8的Tris-HCl緩沖溶液）調(diào)節(jié)pH的預處理方法，再根據(jù)它的內(nèi)毒素限值選用鱟試劑（λ=0.06 EU/ml）、稀釋倍數(shù)160倍，證明對檢測鹽酸溴己新原料中的細菌內(nèi)毒素實驗無干擾。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2015年版四部[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2015： 154-157.

[2] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2015年版二部[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2015： 1107.

[3] 何燕， 陳煒， 羅峰. 鹽酸川芎嗪細菌內(nèi)毒素檢查方法學研究[J]. 中國藥品標準， 2019， 20（5）： 427-432.

[4] 王婭寧， 高龍. 細菌內(nèi)毒素檢查法研究進展[J]. 現(xiàn)代鹽化工， 2019（5）： 59-60.

[5] 雷小平， 陳青連. 雷貝拉唑鈉細菌內(nèi)毒素檢驗方法的建立[J]. 上海醫(yī)藥， 2019， 40（21）： 75-79.

[6] 周勤蘭， 徐遠清， 吳愛莉. 依地酸二鈉細菌內(nèi)毒素檢查法研究[J]. 化工時刊， 2019， 33（7）： 22-26.

[7] 郝翔. 富馬酸伊布利特注射液細菌內(nèi)毒素檢查法研究[J].中國藥品標準， 2019， 20（04）： 356-359.

[8] 劉建輝， 唐先明， 宋麗陽， 等. 鹽酸克林霉素注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的改進[J]. 哈爾濱商業(yè)大學學報（自然科學版）， 2019， 35（4）： 388-391.

[9] 楊晨， 謝益暉， 王賀， 等. 磷酸左奧硝唑酯二鈉細菌內(nèi)毒素檢測方法驗證[J]. 中國藥事， 2019， 33（8）： 944-948.