鮮切蓮藕腐敗的熒光檢測方法

劉永樂，唐 倩，俞 健，劉小芳，陳善輝，李 彥，王發祥

（長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南省水生資源食品加工工程技術研究中心，湖南 長沙 410114）

蓮藕營養成分豐富、口感微甜而脆，同時又可消食止瀉、開胃清熱、滋補養性，是優良的水生蔬菜和副食佳品，深受廣大消費者喜愛[1-2]。我國是蓮藕產銷大國，近年來產銷量均持續增長，2017 1 122.2萬 t，居世界前茅。目前我國蓮藕消費仍以鮮食為主，加工比例僅約5%，深加工領域發展空間較大。鮮切蓮藕是將新鮮蓮藕進行清洗、整修、去皮、切分、保鮮、包裝等加工流程后得到的即食或即用蓮藕制品，因其具有清潔、衛生、新鮮和方便等特點而十分暢銷[3-5]，已成為我國蓮藕加工的主要方式。然而，蓮藕水分含量高，加之加工過程中的去皮、切分等工序使其細胞受損，導致其生理生化反應加劇、容易發生微生物侵染，極易腐敗變質[5-6]，嚴重影響到其質量與安全。因此，研究準確評價鮮切蓮藕產品是否腐敗變質的方法具有重要的現實意義。

食品變質腐敗泛指在微生物為主的各種因素作用下，食品降低或失去食用價值的一切變化，是一個復雜的生物化學反應過程[7-8]。因此，目前尚無統一的評價標準和檢驗方法，主要借助微生物菌落總數、致病菌等傳統的衛生指標進行檢驗[9-10]。然而，傳統的微生物學檢驗方法具有操作復雜、專業性較強、檢驗周期較長、特異性較弱等缺點[11-14]，不能滿足鮮切果蔬產品便捷檢測的需求，急需建立一種方便快捷的檢測方法。熒光檢測具有靈敏度高、選擇性強等優點，目前已廣泛應用于現代食品安全檢測領域[15-17]，但利用熒光指示菌表征果蔬產品微生物腐敗的研究報道較少。

關于蓮藕制品貯藏過程中的微生物污染和腐敗分析，目前的研究主要集中在其優勢腐敗菌的分離鑒定[6,18-19]、產品貨架期預測模型[20-21]等方面，而針對其腐敗變質快速檢測或評價方法的研究較少。在前期研究中，課題組基于聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術對鮮切蓮藕冷藏過程中微生物菌相結構變化進行分析，明確了兩種能自發產生熒光的特異腐敗菌Pseudomonas fluorescens和P. asturiensis可作為潛在的腐敗指示菌用于鮮切蓮藕產品質量安全的評價和快速檢測研究[22]。本研究在此基礎上，根據該指示菌自發熒光的特性，建立一種基于熒光顯影檢測鮮切蓮藕產品微生物腐敗的方法，并進行檢測條件的優化、驗證和相關性分析，以期為相關產品的質量安全評價和便捷檢測新技術開發提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蓮藕：成熟度適中，藕節完整，無機械傷的帶泥蓮藕，購自本地農貿批發市場；大腸桿菌（Escherichia coliBL21），由本實驗室保藏。

金氏B（KB）培養基[23]、營養瓊脂培養基 廣東環凱微生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

C2 Plus激光掃描共聚焦顯微鏡 日本尼康公司；Champ Ge15000增強型全自動凝膠成像儀 北京賽智創業科技有限公司；THZ-98AB恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮮切蓮藕樣品及其懸液制備

新鮮蓮藕按文獻[20]方法切片后置于4 ℃冰箱中冷藏，分別于第0、3、6、9、12天從冰箱取出，在無菌條件下稱取25 g，剪碎（大小約5 mm×5 mm），加入225 mL無菌生理鹽水中，于恒溫振蕩器以25 ℃、120 r/min振蕩15 min制成樣品懸液，用于后續指標分析。

1.3.2 微生物菌落總數測定

按照GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》方法進行。

1.3.3 指示菌自發熒光實驗

稱取適量KB培養基，按使用說明加入蒸餾水和適量甘油，加熱溶解、滅菌后傾注平板。待固體平板冷卻后，用接種環分別點接種對照組（大腸桿菌培養液）和3 個平行實驗組（系列蓮藕懸液樣品），于28 ℃培養箱中培養2 d，分別于可見光和紫外光下觀察結果。

1.3.4 激光共聚焦顯微鏡測定樣品懸液熒光強度

分別取冷藏0、3、6、9、12 d的蓮藕樣品懸液及冷藏第6天的蓮藕懸液稀釋10、100、1 000、10 000 倍，用微量移液槍移取2 μL置于載玻片上，蓋上蓋玻片以激光共聚焦顯微鏡檢測其熒光強度，其中熒光激發波長為405 nm，電壓為105 V，激發器輸出功率為14%；標本在不同視野進行拍攝，將圖片分為強、中、弱3 個等級，選取中等強度的視野代表該樣品的熒光強度[24]，以4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的熒光值表示，計算平均值。

1.3.5 熒光指示菌的便捷檢測方法建立

取不同冷藏時間點的蓮藕樣品懸液，用接種環劃線接種至KB培養基斜面試管，置于28 ℃培養箱中培養2 d，利用凝膠成像系統的紫外模式觀察熒光并拍照，根據檢測到的熒光情況與樣品菌落總數的對應關系驗證利用熒光指示菌檢測樣品腐敗的可行性。每一樣品接種3 支斜面，同時接種1 支大腸桿菌斜面作為陰性對照。

1.3.6 熒光檢測條件的優化

取不同冷藏時間點的蓮藕樣品懸液，分別稀釋0、2.5、5、10、20 倍，用微量移液槍移取10 μL至KB培養基斜面，置于28 ℃培養箱中培養2 d后拍照，以樣品圖像的積分光密度（integrated optical density，IOD）平均值表示熒光強度，根據IOD值變化規律篩選合適懸液稀釋比例；懸液按最佳比例稀釋后，分別接種5、10、15、20、25 μL，按同樣的條件分析計算其IOD值，篩選最佳接種量。

1.3.7 熒光檢測方法的驗證

按1.3.1節方法制備鮮切蓮藕樣品（30 袋），分別在冷藏第0、5、6、7天隨機取樣制備懸液，按1.3.5節的最優條件進行熒光檢測，根據熒光信號是否檢出判定樣品是否腐??；同時按傳統的菌落總數指標法檢測樣品是否腐敗，驗證熒光檢測方法的可靠性。

1.4 數據處理

每組實驗進行3～6 個平行，以 ±s表示，以Microsoft Excel軟件計算并繪制結果圖；激光共聚焦顯微鏡測定的DAPI值采用Leica LSCM軟件計算，KB培養基法獲得的照片采用Gel-Pro Analyzer軟件分析計算IOD值。

2 結果與分析

2.1 鮮切蓮藕冷藏過程中菌落總數的變化

圖 1 鮮切蓮藕冷藏過程中菌落總數變化Fig. 1 Changes in total colony count of lotus root samples during cold storage

如圖1所示，冷藏過程中菌落總數一直呈增長趨勢，新鮮（第0天）樣品為2.1×103CFU/g，冷藏前3 d增加緩慢；此后菌落總數增長加快，第6天時達6.4×104CFU/g。根據浙江大學食品科學與發酵工程研究所2005年起草的《蔬菜（凈菜）質量安全要求》，要求其菌落總數不得超過5×104CFU/g，因此可以認為樣品在冷藏第6天時已開始腐敗變質；冷藏第9天后，樣品菌落總數開始急劇增加，至第12天時已達到4.3×105CFU/g，表明已嚴重腐敗。

2.2 自發熒光指示菌的確認

圖 2 蓮藕樣品懸液接種KB培養基的熒光檢測顯影結果Fig. 2 Fluorescence detection of the bacterial colonies in KB plate from different lotus root samples

在前期研究中，課題組通過PCR-DGGE技術研究了冷藏期間蓮藕的優勢腐敗菌類型和菌相結構變化，發現假單胞菌屬細菌在腐敗關鍵期開始大量增殖，逐漸成為優勢腐敗菌，可以作為評價鮮切蓮藕產品是否腐敗的重要指示菌；尤其是優勢腐敗菌P. asturiensis的檢出時間與腐敗時間一致[22]，且可產生水溶性黃綠色熒光色素[25-26]，可以通過熒光顯影技術檢測[15]。

如圖2所示，第0、3天樣品懸液接種后沒有在KB平板上長出明顯菌落，可能與懸液中微生物數量較少有關；第6天后的樣品才開始長出菌落，且在可見光下呈黃綠色，但對照菌液接種后一直為灰白色菌落。將平板置于紫外光下，在接種第6～12天樣品處可觀察到明顯的熒光，對照菌則不會產生熒光，說明熒光的產生與蓮藕樣品的腐敗菌有關。此外，樣品檢測出熒光的時間與DGGE圖譜[22]中P. asturiensis出現的時間一致，也與通過菌落總數指標判定蓮藕樣品腐敗變質的時間一致。因此，理論上通過檢測熒光表征樣品腐敗變質可行。

2.3 熒光強度與微生物數量的關系

表 1 不同冷藏時間和稀釋度蓮藕樣品懸液的DAPI值Table 1 Fluorescence intensities of suspension cultures of lotus root samples with different cold storage times and dilution factors

激光掃描共聚焦顯微鏡可以定量檢測生物體自發熒光強度[27-28]。如圖3所示，隨著蓮藕冷藏時間的延長，樣品懸液的熒光強度逐漸增強，尤其是第6天后熒光強度急劇上升，至第12天時達到最強（圖3A、表1），說明樣品懸液中熒光指示菌產生的熒光強度與其冷藏過程中菌落總數（圖1）的變化趨勢基本一致。由于蓮藕樣品在冷藏第6天開始腐敗，將冷藏6 d的蓮藕樣品懸液稀釋后進行激光共聚焦熒光檢測。樣品原液的熒光強度最強，隨著稀釋度的增加，熒光強度逐漸減弱（圖3B、表1），說明熒光強度與指示菌數量間具有一定的正相關關系，可以根據指示菌的熒光強度表征樣品的微生物污染程度，從而直觀地分析其腐敗情況[29]。

2.4 熒光檢測方法的建立

激光共聚焦熒光檢測可以較好地根據指示菌的熒光強度表征樣品的微生物腐敗程度，但受限于激光掃描共聚焦顯微鏡的購置和檢測成本，目前采用該方法檢測鮮切蓮藕樣品微生物腐敗仍不現實。因此，需要發展一種相對經濟又便捷的熒光指示菌檢測方法。圖4為不同冷藏時間的蓮藕樣品懸液接種KB斜面后利用凝膠成像系統照相獲得的照片。各組陰性對照的斜面試管（第4支）均無熒光產生，樣品試管從冷藏第6天開始檢測到熒光，這一時間點與圖1的結論（開始腐敗的時間點為第6天）吻合。因此，可以用樣品熒光指示菌的檢出表征樣品的微生物腐敗，該方法較激光共聚焦檢測更實惠，同時較傳統衛生指標檢測法更簡單快捷。然而，可能由于劃線接種量的不確定性，樣品的熒光強度與其微生物菌落總數的線性對應關系還不理想，尚需對其熒光檢測條件進一步優化。

圖 4 不同蓮藕樣品懸液接種KB斜面后的熒光檢測結果Fig. 4 Fluorescence detection of suspension cultures of different lotus root samples inoculated on KB slopes

2.5 熒光檢測條件的優化

2.5.1 稀釋度的選擇

圖 5 不同稀釋度蓮藕懸液接種KB斜面后的熒光檢測結果Fig. 5 Fluorescence detection of suspension cultures of lotus root samples with different dilution factors inoculated on KB slopes

如圖5所示，對照和第0天樣品斜面試管均無熒光產生，而冷藏6 d以后樣品的各稀釋度斜面均檢測到熒光，且強度基本隨冷藏時間的延長逐漸增強，再次印證了利用指示菌熒光檢測表征樣品微生物腐敗的可行性；然而，原液和稀釋2.5、5 倍的第3天樣品各有1 支試管檢測到微弱熒光，說明不合適的樣品懸液稀釋度可能會影響檢測結果的準確性，因此，后續選取稀釋10 倍作為最佳稀釋度。

2.5.2 接種量的確定

在不同蓮藕樣品均稀釋度懸液均稀釋10 倍的基礎上，進行不同接種量實驗，斜面培養后的熒光檢測結果如圖6所示。接種量為5、10 μL的樣品均第6天開始出現熒光，且隨著接種量的增加，熒光強度逐漸增強；而接種量大于15 μL后，冷藏第3天樣品試管也能檢測到熒光，說明接種量太大造成假陽性結果。分析計算接種5 μL和10 μL實驗組樣品圖像的IOD值，發現當接種量為5 μL時其與冷藏時間的相關性更好（圖7）。因此，最終確定樣品懸液稀釋10 倍、接種量5 μL為熒光指示菌便捷檢測方法的最優條件。

圖 6 不同接種量蓮藕懸液于KB斜面培養后的熒光檢測結果Fig. 6 Fluorescence detection of suspension cultures of lotus root samples at different inoculum amounts inoculated on KB slopes

圖 7 最佳檢測條件下的樣品IOD值與冷藏時間的關系Fig. 7 Relationship between cold storage time of lotus root samples and fluorescence intensity under optimal conditions

2.6 檢測方法的驗證

隨機選取10 個不同凍藏時間的鮮切蓮藕樣本，分別以本研究的熒光檢測方法和傳統的微生物菌落總數分析法進行樣品微生物腐敗檢測對比，結果如表2所示。除冷藏第5天的樣品檢測到微弱熒光外（導致這一結果的原因可能與樣品腐敗菌的個體差異和稀釋或接種操作有關[30]），其余樣品均與傳統方法檢測的結果一致，準確率高達90%，說明本研究建立的利用熒光指示菌檢測鮮切蓮藕腐敗的方法可行。

表 2 熒光檢測法與傳統方法的檢測結果比對Table 2 Comparison of the results of fluorescence detection and traditional detection methods

3 結 論

本研究基于前期PCR-DGGE技術明確了鮮切蓮藕冷藏過程中優勢腐敗菌P. asturiensis的檢出時間與腐敗時間點的一致性，應用其自發熒光的特點建立了一種基于熒光顯影表征鮮切蓮藕產品微生物腐敗情況便捷檢測方法。通過熒光指示菌的確認、熒光強度與微生物數量的相關性分析、熒光檢測方法建立及其檢測條件的優化，最終對實際樣品腐敗檢測的驗證結果與傳統菌落總數檢驗方法基本一致。與傳統微生物衛生指標檢驗方法相比，該熒光檢測方法操作簡便、結果直觀，而且檢出準確率高，是一種便捷可行的蓮藕腐敗檢測方法。