基于頂空氣相色譜-離子遷移譜的不同產地咖啡揮發性有機物指紋圖譜分析

弘子姍，譚 超*，苗 玥，龔加順

（云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201）

咖啡是世界性飲料[1-2]，也是世界上主要的農產品之一，在世界市場上的交易僅次于石油[3]。全球大部分的咖啡產區都位于南北回歸線之間的熱帶地區，有近70 個國家生產出口咖啡豆[4]，但產量、品質和風味卻參差不齊。苦、酸、澀、甜是咖啡的主要風味，與風味相關的化學物質又以油脂、蛋白質、生物堿類（咖啡因、葫蘆巴堿）、酸類物質等為主[5-6]。咖啡中的咖啡因形成咖啡風味強度及苦味，在烘焙過程中其含量變化不大。Fujiokal等[7]認為綠原酸形成咖啡的苦酸澀味，高綠原酸會降低咖啡品質[8]。咖啡中揮發性和非揮發性的綠原酸、檸檬酸、蘋果酸、乙酸、奎寧酸等形成咖啡酸味[9]。而咖啡中三酸甘油脂、萜烯、生育酚類、甾醇類形成了咖啡的醇厚感。多種化學物質影響咖啡風味，而咖啡風味又與其品質息息相關。目前，國際上主要通過分析香氣、酸度、風味、醇度、余韻等指標，杯測咖啡豆對品質進行評判，評判標準主要是美國精品咖啡協會制定的杯測體系，其中的風味輪涵蓋了大部分咖啡口味種類和專業術語，可以幫助人們建立咖啡風味的記憶庫，辨別咖啡味道，區分好壞。但這種體系帶有個人主觀意識，有時會給評價帶來一些偏差。目前用于風味香氣檢測的技術主要為固相微萃取-氣相色譜-質譜、電子鼻和聯用技術、全二維氣相色譜-質譜技術、氣相色譜嗅聞分析等[10-15]，但存在氣體傳感器陣列漂移現象、易受外界環境因素影響、前處理復雜及應對復雜樣品分析復雜等問題[16-17]。Ongo等[18]研究表明咖啡品種和地理來源決定了咖啡香氣和揮發性有機物（volatile organic compounds，VOCs）的變化，如何準確用數據衡量咖啡風味、鑒別品種和地理來源是亟待解決的難題。

氣相離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是一種高分辨率、高靈敏度、分析高效、操作簡便的氣體快檢技術[19-21]。樣品不需前處理，通過頂空進樣快速捕捉樣品中痕量VOCs信息（低至μg/m3級別，甚至ng/m3級別），形成指紋圖譜，用于鑒別樣品的真偽、新鮮度、貨架期、品種品質區分等，GC-IMS技術可以實現樣品中物質的二次分離，基于物質GC保留指數和遷移時間二維交叉定性，保留指數定性和氣相色譜完全一致，均使用NIST數據庫，并結合遷移時間可精準定性，無需標準品進行驗證。目前該技術在咖啡VOCs風味分析中應用較少，主要集中在毒品[22]、肉類[23-24]、茶葉、菌類檢測及香水研發等領域[25-26]。在咖啡風味分析，特別是指紋圖譜分析鮮見報道。

本研究以8 個不同地區生熟咖啡豆為實驗材料，采用GC-IMS技術對咖啡豆中復雜VOCs進行采集和痕量分析，利用匹配矩陣和聚類分析，以數據可視化形式對咖啡豆品種、產地鑒別，以期為烘焙特征成分變化提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同產地咖啡豆均為全水洗法加工的咖啡豆，一部分直接打粉編號（AF、BF、CF、DF、EF、FF、GF、HF），另一部分烘焙后打粉編號（AB、BB、CB、DB、EB、FB、GB、HB）。“A～H”代表8 種不同產地的咖啡，“F”代表生豆咖啡粉，“B”代表烘焙咖啡豆粉。樣品編號及對應名稱、栽培面積、海拔、生產季節、杯測風味如表1所示。

表 1 咖啡樣品Table 1 Coffee samples used in this study

SANTOKER R500E烘焙機 北京三豆客科技有限公司；FlavourSpec?頂空（headspace，HS）-GC-IMS食品風味分析與質量控制系統（配有CTC自動頂空進樣器、Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析軟件及GC×IMS Library Search Software定性軟件） 德國G.A.S公司。

1.2 方法

1.2.1 咖啡烘焙條件

烘焙機參數：氣源為液化石油氣，火力為0.5 kPa，風門為4，轉速為60 r/min。烘焙生豆質量約500 g，入豆溫度180～190 ℃，烘焙時間15～20 min，中深度烘焙（Agtron控制為60～75，失水率控制為12%～15%）[27]。烘焙日期2018年8月22日。杯測標準為盲測，參照美國精品咖啡協會杯測標準。

1.2.2 HS-GC-IMS測定條件

HS-GC條件：1 g樣品于20 mL頂空進樣瓶中，40 ℃孵化20 min，經頂空進樣200 μL用GC-IMS儀FlavourSpec?進行測試。載氣N2（純度≥99.999%）；進樣針溫度45 ℃；FS-SE-54-CB-1色譜柱（15 m×0.53 mm，1 μm）；載氣流量：0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～15 mL/min；10～20 min，20～80 mL/min；20～40 min，100～130 mL/min。

IMS條件：漂移管長度98 mm；管內線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣N2（純度≥99.999%）；漂移氣流速150 mL/min；放射源β射線（氚，3H）；離子化模式：正離子。

1.3 數據處理

經LAV和GC×IMS Library Search Software軟件分析得出樣品中VOCs的差異譜圖，并建立匹配矩陣，利用NIST數據庫和IMS數據庫對物質定性分析。采用MeV 4.9進行3D-主成分分析（3D-principal component analysis，3D-PCA）及聚類熱圖分析。

2 結果與分析

2.1 不同產地生咖啡豆粉及對應烘焙咖啡豆粉VOCs差異對比

圖 1 不同產地咖啡豆烘焙前后HS-GC-IMS譜圖比較Fig. 1 Comparison of HS-GC-IMS spectra of raw and roasted coffee powders collected from different regions

從圖1可以看出，圖譜中左側一條豎線為反應離子峰（離子遷移時間約為7.81～7.89 ms）。離子峰兩側的每一個點代表一種VOCs。顏色代表物質的濃度，白色表示濃度較少，黑色表示濃度較大，顏色越深表示濃度越大。整個譜圖即代表了樣品的HS成分。

對比生熟咖啡豆粉，8 支生咖啡豆樣品烘焙后均呈現復雜風味物質體系，VOCs種類大量增加。生咖啡豆中VOCs在1 600 s完成GC分離，30 ms內完成IMS分離且分離度較高。而烘焙咖啡豆中VOCs在較短時間800 s完成GC分離，30 ms內完成IMS分離且分離度高，但由于VOCs種類較多出現了部分堆疊。

對比8 支不同產地生咖啡豆粉，由圖1A、B、C、D、E可以明顯看出，具有相同保留時間和遷移時間的VOCs，累積含量具有明顯不同，這5 個點可作為區分不同產地生咖啡豆粉的指紋特征參照點。生長環境、品種等因素會影響生咖啡豆中醇、酸、醛、酮、酯、酚等小分子VOCs的含量，可通過VOCs的種類增減及含量判別不同產地生咖啡豆。

對比8 支不同產地烘焙咖啡豆粉，由圖1F、G、H、I、J可以明顯看出，具有相同保留時間和遷移時間的VOCs，累積含量也具有明顯不同，也可作為區分不同產地烘焙咖啡豆粉的指紋特征參照點。每個指紋特征點對應形成的風味也不同，咖啡的風味形成與咖啡豆本底品質和烘焙有密切關系。在烘焙過程中焦糖化反應與美拉德反應共同作用產生咖啡特有的揮發性芳香物質，這些物質包括醇、酸、醛、酮、酯、酚類化合物等，這些風味物質在紅酒、果汁、奶油等食物中同樣被檢出，因此成就了烘焙咖啡特殊的花香、果香、甜香、奶油、焦糖香等特殊杯測風味。

縱向對比同一產地生咖啡豆粉和烘焙豆粉，由圖1K、L、M、N、O可以看出，相同保留時間和遷移時間的VOCs，烘焙后5 個特征VOCs消失，通過專用譜庫分析，烘焙后一些特殊的醚、醇、醛、酮、酯會減少，可作為識別生熟咖啡粉區別指紋特征點。

圖 2 不同產地生咖啡豆（A）和烘焙咖啡豆（B）HS-GC-IMS譜圖中VOCs圖庫Fig. 2 Gallery patterns of VOCs in HS-GC-IMS spectra of raw and roasted coffee beans collected from different regions

2.2 不同品種生咖啡豆粉及烘焙咖啡豆粉指紋圖譜

基于LAV軟件的Gallery Plot插件篩選的、具有明顯變化規律的8 支不同產地生咖啡豆粉76 種VOCs離子峰見圖2A，8 支不同產地生咖啡豆粉具有共同的VOCs，但含量不同。樣品組內成分含量具有明顯的差異性。圖中每一行為一個咖啡樣品（每個樣品做3 個平行），由該樣品所含的全部VOCs信號峰組成，每一列為同一保留時間及遷移時間下的有機物（不同樣品中相同的物質）的信號峰。可以看出，樣品DF的風味物質最為豐富，其次是HF樣品，DF樣品中濃度最高，包含苯甲醛、γ-丁內酯、異戊酸、己醛、2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2,3-丁二醇、乙偶姻、丙醇、乙酸甲酯、雙乙酰、戊醛、異丁醇等，尤其是2-戊酮，只存在于DF樣品中。咖啡的特征香氣是由不同種類、濃度的揮發性物質決定的[28]。印度尼西亞蘇門答臘獨特的環境和氣候賦予了曼特寧咖啡本底風味，加之印尼式半水洗法[29]造就了DF豐富濃郁的香氣，使得DF風味極強，甚至評價曼特寧厚重濃烈，是咖啡中的“愷撒大帝”，測試結果也表明DF風味最豐富；在AF樣品中，丁酸、3-甲基丁醇、3-戊酮、丙酮的含量較高。

圖2B為篩選出的具有明顯變化規律的8 支不同產地烘焙咖啡豆粉104 種VOCs離子峰圖。8 支不同產地烘焙咖啡豆粉具有共同的VOCs，樣品組內成分含量也具有一定差異性。烘焙過后的咖啡粉風味差異較小，DB、HB樣品中己醛、2-甲基丁酸甲酯含量較高，而乙醇、乙酸乙酯、丙烯酸乙酯等物質在BB、FB中含量較高。

2.3 樣品相似性分析

基于MeV的3D-PCA分析樣品相關性，由圖3可以看出，不同產地的8 支生咖啡豆粉樣品，蘇門答臘多巴湖產區的曼特寧DF與布隆迪產區咖啡豆HF的VOCs較為特別，而高晟莊園A卡蒂姆AF與巴西咖啡BF風味相似，哥倫比亞慧蘭CF、肯尼亞AA EF、危地馬拉FF和耶加雪菲-沃卡GF的風味較為接近，但仍有差異。

圖4表明，8 支烘焙咖啡豆粉，哥倫比亞慧蘭CB、肯尼亞AA EB、耶加雪菲-沃卡GB的VOCs較為接近，而蘇門答臘多巴湖產區的曼特寧DB、布隆迪產區咖啡豆HB、危地馬拉FB、高晟莊園A卡蒂姆AB與巴西咖啡BB風味具有明顯差異。

圖 3 不同產地生咖啡豆的3D-PCA圖Fig. 3 3D-PCA plots of raw coffee beans collected from different regions

圖 4 不同產地烘焙咖啡豆的3D-PCA圖Fig. 4 3D-PCA plots of roasted coffee beans from different regions

圖 5 生咖啡豆與烘焙咖啡豆匹配矩陣Fig. 5 Matching matrixes of raw and roasted coffee beans

圖5 匹配矩陣可以更為直觀反映樣品之間差異和區分度，圓點面積越大，匹配度高，表示相似程度越高，區分度越低。

從咖啡成分差異上看[30-31]，當匹配度在85%～90%時（紅色區塊），說明樣品中有約10%～15%的不同特征成分或成分含量明顯差異。生咖啡豆粉中DF的VOCs特征指紋與其他樣品差異明顯，有較高識別性。AF、BF、HF也能較好辨識，僅分別和EF、CF、EF有相似性。CF、EF、FF、GF較難從8 支生咖啡豆粉中辨識。烘焙咖啡豆粉中AB、BB、GB均有較好辨識度，僅分別和CB、FB、EB具有相似性。CB、DB也具有一定辨識度，EB辨識度相對較差。匹配度不小于90%（藍色區塊），8 支生咖啡豆粉之間均具有差異，烘焙豆粉也相同，表明通過HS-GC-IMS指紋特征當匹配度不小于90%，通過譜圖中細微特征成分分析可以精確辨識咖啡豆粉產區。

從地域差異上看，阿拉比卡種咖啡傳播歷程大致為非洲（埃塞爾比亞）→阿拉伯半島（也門）→亞洲（印尼）→歐洲（阿姆斯特丹）→美洲（巴西）→非洲（埃塞爾比亞）。1706—1713年咖啡從印尼爪哇傳入歐洲的阿姆斯特丹植物園，隨后跨越西半球傳入美洲，中南美洲阿拉比卡咖啡種植歷史也是在1718—1790年期間。指紋圖譜數據也印證了當匹配度在85%～90%時，南美巴西咖啡BB、南美哥倫比亞慧蘭CB、南美危地馬拉FB的VOCs特征指紋相似，3 支咖啡產區均為南美洲具有地域相似性。在1706—1713年咖啡傳入歐洲后，1718年又從歐洲法國傳入南美，與此同時1824年左右法國傳教士帶入越南再引入中國云南賓川。南美哥倫比亞慧蘭CB、南美危地馬拉FB、中國高晟莊園A卡蒂姆AB的VOCs特征指紋相似，3 支咖啡中產區2 支為南美1 支為亞洲，因種屬相似所以存在共同性。大約公元575—850年，咖啡從非洲（埃塞俄比亞）傳入阿拉伯半島（也門），1658年荷蘭人將咖啡從阿拉伯半島帶到印度，隨后傳到亞洲印尼爪哇。南非肯尼亞AA EB、南非布隆迪產區咖啡豆HB、東非耶加雪菲-沃卡GB和亞洲印尼曼特寧DB存在特征指紋相似性。

3 結 論

本研究以8 支不同產地生咖啡豆為原料，基于HSGC-IMS分析生咖啡豆粉之間、烘焙咖啡豆粉之間及生熟豆粉之間VOCs具有差異性。從指紋圖譜，3D-PCA及匹配矩陣分析可以看出，HS-GC-IMS指紋特征當匹配度不小于90%，可通過指紋圖譜中細微特征成分的不同精確辨識生、熟咖啡豆粉產區。

HS-GC-IMS能夠彌補常規咖啡杯測帶來的不足，使得杯測更有數據依據，也能夠對不同產地咖啡豆生、熟粉進行區分，為咖啡的大數據甄別提供理論依據和數據支持。