小分子糖及其類似物與α-葡萄糖苷酶的分子對接

徐曉梅，溫家穎，王慶華,

（1.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學藥學院，廣東 廣州 510006）

α-葡萄糖苷酶是人體腸道內碳水化合物消化吸收的關鍵酶類，它對包括糖蛋白及糖脂的形成以及碳水化合物在小腸內部的消化過程和控制體內血糖水平起著舉足輕重的作用[1-2]。α-葡萄糖苷酶抑制劑通過競爭性抑制小腸黏膜刷狀緣上的α-葡萄糖苷酶，能顯著延緩碳水化合物向單糖的轉化，降低飯后的血糖峰值[3-4]。世界衛生組織根據現今糖尿病的發病率預測大概到2025年全球可能有3億，甚至更多的人會患糖尿病，或受到糖尿病的干擾和威脅[5]。α-葡萄糖苷酶抑制劑已經被我國糖尿病防治指南建議為一線藥物，尤其適用于喜食含高碳水化合物食物的東方人群[6-7]。除此之外，該領域學者更希望能通過提倡對輔助降血糖食品的食用，用食療的方法調節血糖水平，有效預防糖尿病。在輔助降糖保健食品中糖類及其類似物質作為重要的α-葡萄糖苷酶抑制劑之一，在降血糖方面起著十分重要的作用。

隨著計算機技術的發展，計算機輔助藥物設計[8]的方法已經得到廣泛應用，分子對接技術是其重要的組成部分。分子對接技術[9]則是基于藥物分子結構的設計過程中一個很關鍵的方法，它是利用空間構象和相互作用在結合位點之間不斷地去定位和去尋找出最佳的匹配狀態。AutoDock是美國Scripps研究所Olson實驗室開發與維護的一款分子對接模擬軟件，主要應用于配體-蛋白質分子對接，用來預測生物大分子和小分子配體之間的相互作用的自動化程序[10-11]。AutoDock優勢在于通過快速的基于格點能量的計算方法和有效的扭轉自由度搜索方法這兩種方法，很好地平衡了精準計算與合理計算資源之間的矛盾，大大節省了科研人員耗費在晶體結構修飾的時間[12-14]。

本研究利用AutoDock軟件對20 種小分子單糖及其類似物與α-葡萄糖苷酶進行模擬對接，探索其作用的機理，通過合理藥物設計的方法結合受體與配體的相互作用規律，進一步優化改造提取物質抑制劑分子結構，以期為獲取更高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

AutoDock 4.2及AutoDock Tools 1.5.6軟件從官網（http://autodock.scripps.edu/）下載，α-葡萄糖苷酶的3D結構程序數據庫文件（program database file，PDB）從PDB數據庫（http://www.rcsb.org/）下載，編號為2QMJ，保存。20 種小分子結構sdf文件從Pubmed數據庫下載，再通過Openbabel軟件把sdf格式轉換為PDB格式保存。

1.2 AutoDock 4.2軟件分子對接步驟及對接參數的設置

1.2.1 配體和受體的預處理

經軟件Swiss-PdbViewer 4.1分析發現2QMJ文件里的蛋白結構缺失了7 個氨基酸氨基酸殘基，分別是Ser1、Ala2、Glu3、Cys4、Pro5、Val6、Gln837，補全氨基酸殘基，得到完整的受體結構PDB文件。將補全氨基酸殘基后的2QMJ文件導入到AutoDock中，刪去2QMJ受體文件所含的NAG、GOL、ACR等基團，去水加氫，計算Gasteiger電荷，合并非極性氫原子，文件保存為2QMJ.pdbqt[15-16]。AutoDock 4.2可以選擇柔性或剛性對接，但選取柔性基團的不確定因素較多，因此本實驗仍采取剛性形式對接。AutoDock讀入配體，合并非極性氫原子，加Gasteiger電荷，使其保持最小能量狀態[17-18]，將文件保存為Acrbose.pdbqt。AutoDock Tools 1.5.4軟件中的Ligand子程序包可自動檢測可旋轉鍵的個數，在對接過程中，這些鍵可以靈活旋轉與受體分子對接。

1.2.2 配體受體對接過程

將2QMJ酶的氨基酸殘基序列導入BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）進行分析，結果顯示2QMJ的活性位點在第300～600位氨基酸殘基之間，確定以第441位氨基酸殘基Trp441坐標作為中心坐標，坐標值為（-21.56，-6.936，-1.971）。對接參數格點間距設置為0.375 ?，大小為60 ?×60 ?×60 ?，其大小能夠保證配體完全處在酶活性中心范圍內，配體構象搜索過程使用半經驗打分函數與拉馬克遺傳算法[19]。由于本次選取的20 個小分子的柔性鍵不多，故算法對接的輪數設為50，在分子對接運行過程中，能量評估的最大數目，平移步驟大小及其他參數取默認值[20]。

1.3 新型小結構分子結構的構建

在Window寫字板中打開所需改造小分子結構PDB的文件，將目標原子更改為新的原子字母符號，重新保存為PDB文件，即可得到新的配體分子結構的PDB文件用于對接實驗。

1.4 數據統計及圖表繪制

圖表以Excel軟件繪制，以SPSS 20.0軟件統計包進行t檢驗統計學處理。相關小分子與酶對接的圖均由AutoDock軟件導出。

2 結果與分析

2.1 對接方法的準確性驗證

選取臨床降血糖常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶進行對接，以驗證AutoDock 4.2參數設置的準確性。將2QMJ結構活性中心所結合的ACR（即阿卡波糖分子）取出作為配體，與刪去了此配體的2QMJ酶重新對接。結果顯示對接結合自由能最低為-7.63 kcal/mol，其均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）值為1.99，小于2。一般認為RMSD值小于2，即可保證小分子配體與受體進行有效對接[21-22]。圖1B為Acrbose1_1與2QMJ活性中心的對接結果，可見阿卡波糖已經成功地嵌入α-葡萄糖苷酶表面的活性中心中，說明本實驗的參數設置合適，能較合理地模擬抑制劑與酶在活性中心的結合構象，對接方法可信。

圖 1 阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶對接結果圖Fig. 1 Molecular docking between acarbose and α-glucosidase

2.2 20 種小分子單糖及其類似物的分子對接

20 種小分子的活性數據及軟件預測的最低對接結合自由能見表1。本研究所采用20 種小分子單糖及類似物對α-葡萄糖苷酶活性IC50的數據來自文獻[23]。以對接結合自由能（每種配體分子選擇構象最低的結合自由能）為橫坐標，抑制劑pIC50為縱坐標，考察20 種小分子單糖及類似物的對接結合自由能與pIC50關系，其回歸方程為：y=-0.936 2x-3.923 7，r=0.738 9。從r值看，結合自由能和pIC50具有很緊密的相關性。上述結果顯示由AutoDock 4.2預測的結合自由能與實驗測得的pIC50存在可以接受的相關性，從另一方面說明通過AutoDock 4.2的分子對接大致可以預測抑制劑對α-葡萄糖苷酶IC50。

表 1 20 種小分子對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及對接結合自由能Table 1 Inhibitory effects and binding free energy of 20 small molecules and their analogues against α-glucosidase

通過AutoDock和UCSF Chimera P軟件[24]分析20 種小分子配體與酶對接后的復合物和α-葡萄糖苷酶之間的氫鍵作用。發現酶活性中心點氨基酸殘基中，Asp542、Asp443、His600、Asp327和Arg526最容易與小分子配體的H、O原子形成氫鍵作用，這些氨基酸殘基在與小分子結合時發揮較為重要的作用，尤其以Asp542、Asp327和Asp443與小分子配體形成氫鍵的機會最大，這是因為Asp側鏈基團為羧基，其上的兩個氧原子很容易與小分子配體上的氫形成氫鍵。此外范得華力和靜電相互作用等非鍵相互作用在酶活性中心與小分子配體形成穩定的結合構象中也起了非常重要的作用。圖2顯示了1-脫氧野尻霉素和井岡霉按與α-葡萄糖苷酶活性中心氨基酸殘基之間的相互作用。

圖 2 1-脫氧野尻霉素（A）和井岡霉胺（B）與α-葡萄糖苷酶對接氫鍵作用圖Fig. 2 Hydrogen bonding of 1-deoxynojirimycin (A) and validamine (B)with α-glucosidase

2.3 假單糖分子的分子對接

在20 個小分子中，1-脫氧野尻霉素的對接結合自由能為-8.26 kcal/mol，井岡霉胺為-8.79 kcal/mol，大大低于其他化合物，說明兩種化合物與酶的結合較為牢固，這與兩者同屬于強效α-葡萄糖苷酶抑制劑的性質一致。雖然其中的單糖分子結構與1-脫氧野尻霉素、井岡霉胺等結構相似，但這些單糖與后兩者的對接結合自由能卻相差很大，提示1-脫氧野尻霉素和井岡霉胺環上的N原子和C原子可能是影響對接結合自由能的重要因素。將其中的8 種單糖（葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、海藻糖、果糖、2-脫氧-D-葡萄糖和6-脫氧-D-葡萄糖）糖環上的O原子分別替換為N原子和C原子，構建新的假單糖化合物與酶進行對接，比較每種單糖與原子替換后的N假單糖和C假單糖的結合自由能，結果見表2。

表 2 8 種單糖與假單糖分子對接結合自由能Table 2 Binding free energies of eight monosaccharides with pseudomonosaccharide molecules

單糖與N假單糖兩組間對接結合自由能t檢驗結果：t=8.76×10-10，顯示兩組間結合自由能存在顯著性差異，說明把單糖糖環上的O替換為N后，假單糖分子對接結合自由能減小，可見新構建的假糖分子比相應的單糖分子與酶的結合能力更強。

單糖與C假單糖兩組間對接結合自由能t檢驗結果：t=0.34，兩組間無顯著差異，說明把單糖糖環上的O原子替換為C原子后，假糖分子和單糖分子的對接結合自由能的差異無意義，單糖糖環上的O原子替換為C原子不影響單糖分子與受體的結合，同時也從另一個方面顯示了N原子對此類結構的化合物與酶活性中心結合的重要性。

2.4 假井岡霉胺分子對接

對接結果中井岡霉胺的結合自由能是最小的，其結構與單糖分子亦相似，差別在于側鏈有—NH2和雜環內的O原子。根據這一特點，用軟件設計了5 種形式改造的假井岡霉胺分子，用AutoDock分別與α-葡萄糖苷酶進行對接。井岡霉胺結構如圖3所示。

圖 3 井岡霉胺結構示意圖Fig. 3 Chemical structure of validamine

表 3 井岡霉胺改造后的對接結合自由能Table 3 Binding free energy after modification of validamine

表3顯示，化合物2、4中，不管在R1位還是R2位，只要引入N原子，對接結合自由能與井岡霉胺的結果基本一致；化合物1、3中，R1和R2位均無N原子，對接結合自由能較大，顯示與酶的結合能力減弱；化合物5中，R1和R2位同時引入N原子，對接結合自由能明顯變小，結合程度變得更牢固。上述結果提示，在類似的小分子結構中，N原子在與α-葡萄糖苷酶對接中起著非常重要的作用。含N原子的六元雜環結構的小分子帶—NH2取代基后，能大大提高配體與受體的親和力，其可能原因是N原子替換后，雖然這些生物電子等排體的鍵角和空間結構非常相近，但是電負性和疏水性不同，因此替換后會發生生物活性改變，與受體的親和力也隨之變化[25]。

3 結 論

對接結合自由能打分是AutoDock分子對接技術關于對接結果優劣的最簡單、最直接的評價，對接結果給出的結合自由能越低則打分越高，打分最高構象配體與受體的結合是最牢固的結合模式[26-28]。本研究中20 種小分子化合物對接結合自由能與其抑制實驗中得到的pIC50數據基本呈負相關，說明小分子與酶對接結合自由能越小，抑制效果越好。從對接結果中還發現Asp542、Asp443、His600、Asp327和Arg526易與小分子配體的H、O形成氫鍵，其中顯示Asp542和His600對酶活性最為重要。單糖分子改造后的結果顯示是N原子的存在使得氫鍵更易產生，大大增強了配體與受體的結合和穩定程度。對井岡霉胺分子進行5 種形式改造后，當分子結構環內引入N原子或有NH2取代基時，對接結合自由能明顯變小，結合程度變得更強。以往也有研究人員在酶活性抑制實驗中發現很多胺類物質是許多糖苷酶的抑制劑，并認為堿性糖衍生物（特別是糖胺）比相應的中性類似物具有更強的抑制葡萄糖苷酶活性的能力[23]，岳保珍等[29]發現3 種氮雜糖對α-或β-葡萄糖苷酶呈現競爭性抑制。雖然本研究所構建的假單糖或假井岡霉胺分子不一定存在，但研究結果顯示N原子在α-葡萄糖苷酶抑制劑設計中具有很重要的意義，未來可以更多關注含N雜環結構的化合物，提取或合成此類具有更強活性的α-葡萄糖糖苷酶抑制劑。

相較于單純純化學合成的α-葡萄糖苷酶抑制劑，天然來源的具有綠色、安全、毒副作用小等特點。然而植物來源α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究也存在一定局限性，目前研究著重于分離和提取單體化合物并利用體外酶活性篩選模型篩選活性單體，但在天然活性化合物的藥物化學、藥理學及臨床研究方面尚有欠缺[21,30]。本研究借助AutoDock軟件對20 種小分子單糖及其類似物與α-葡萄糖苷酶進行模擬對接研究，探索其作用的機理，以便通過合理藥物設計的方法結合受體與配體的相互作用規律，進一步優化改造提取的抑制劑分子結構，為更高效葡萄糖苷酶抑制劑的獲取提供了新思路。