3-甲基丁醛對奶酪堅果風味的貢獻及其生物合成的研究進展

陳 臣，周文雅，袁佳杰，于海燕，田懷香,*

（1.上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418；2.揚州市揚大康源乳業有限公司，江蘇 揚州 225004）

奶酪又名干酪，是指以牛奶、奶油、部分脫脂乳、酪乳或這些產品的混合物為原料加入凝乳酶，乳蛋白質（主要是酪蛋白）凝固后，排除乳清，而制成的新鮮或發酵成熟的乳制品[1]。近年來，隨著人們健康意識及消費水平的提高，我國奶酪行業也呈現快速增長趨勢，銷售額年均增速近30%[2]。但是從橫向對比來看，我國目前奶酪人均年消費量僅有0.04 kg，僅為日韓的1/50[3]，未來奶酪市場發展空間潛力巨大。

盡管不同來源及品種的奶酪風味存在差異，但總地來說，奶酪的風味特征主要包括奶香味、堅果味、肉湯味、硫味、酸味、鮮味、苦味、乳清味、水果味、脂肪酸味等[4]。在這些特征風味中，成熟奶酪產生的“堅果味”受到了國內外，特別是受到中國消費者的偏愛[5]。研究表明，支鏈醛，如2-甲基丁醛、3-甲基丁醛和2-甲基丙醛，具有堅果/麥芽風味，是許多硬質和半硬質奶酪中的關鍵風味化合物。在這3 種化合物中，因3-甲基丁醛的平均風味閾值（在水溶液中為0.06 μg/mL）較另外兩者低[6]，對堅果風味貢獻較大而備受關注。

支鏈醛，尤其是3-甲基丁醛能賦予奶酪堅果風味，所以總結3-甲基丁醛對奶酪的風味貢獻及其生物合成研究進展，有助于闡明支鏈醛對于奶酪風味的貢獻及奶酪堅果味的形成機制，對于開發并生產符合中國人口味的奶酪具有很大的意義。本文在查閱相關文獻的基礎上綜述了3-甲基丁醛對奶酪堅果風味的貢獻、生物合成途徑及其合成的調控措施，并展望了在研究3-甲基丁醛過程中所出現的問題以及未來的研究熱點。

1 3-甲基丁醛對奶酪風味的貢獻

表1 富含3-甲基丁醛的奶酪總結Table 1 A summary of cheeses rich in 3-methylbutanal

支鏈醛是許多奶酪產品的特征香氣化合物（表1），其中3-甲基丁醛作為切達奶酪關鍵風味物質的研究已有諸多報道。早在2004年，Avsar等[17]通過描述性感官分析與定量測定揮發性香氣成分相結合的方法，確定了3 種支鏈醛（2-甲基丙醛、2-甲基丁醛和3-甲基丁醛）都是奶酪中產生堅果風味的主要化合物，其中3-甲基丁醛對堅果風味的貢獻最大。Christensen等[18]則利用分子蒸餾技術測定成熟3 年切達奶酪中的揮發性風味物質，通過香氣抽提物稀釋分析法發現3-甲基丁醛是成熟切達奶酪中的關鍵香氣化合物。研究表明3-甲基丁醛在切達奶酪中的最適含量是73～210 μg/kg[19]，在這個含量范圍內其對奶酪的風味貢獻是堅果味，而且是均衡、理想的風味。

除切達奶酪以外，在許多硬質和半硬質奶酪中，如格魯耶爾奶酪、藍紋奶酪、帕瑪森奶酪等，3-甲基丁醛都是重要的風味化合物。Jo等[11]通過頂空固相微萃取和氣相色譜-質譜的方法來分析高達奶酪的揮發性香氣化合物，發現3-甲基丁醛是高達奶酪的關鍵揮發性香味化合物之一，適量的3-甲基丁醛能賦予高達奶酪類似巧克力的風味。Ayad等研究表明3-甲基丁醛在Proosdij型奶酪中也是一個主要風味化合物，呈現出類似巧克力的風味/堅果風味[12]。3-甲基丁醛不僅在西式奶酪中普遍存在，在中國傳統的一些奶酪中，3-甲基丁醛也對風味產生貢獻。王蓓[14]、馬艷麗[15]等發現3-甲基丁醛在中式酸凝奶酪，例如在奶疙瘩、奶豆腐中，對其風味也會產生一定的影響。此外，馬楊[16]在測定新疆酸凝奶酪在成熟過程中揮發性風味物質的變化時，檢測到3-甲基丁醛的相對含量會隨著奶酪成熟而增加。

支鏈醛一般在奶酪成熟6～9 個月開始由氨基酸分解代謝產生，其含量隨著奶酪成熟時間的延長而增加[8]。Avsar等[17]發現切達奶酪只有在成熟時間大于9 個月時，才會產生大量的3-甲基丁醛，Lazzi等[20]發現Grana Padano奶酪在成熟過程中，3-甲基丁醛含量顯著增加。Carunchia Whetstine等[21]發現與未成熟奶酪相比，成熟奶酪中其他風味的存在（如硫味）會顯著增強支鏈醛對堅果風味的貢獻。盡管3-甲基丁醛被認為對奶酪風味有重要貢獻，但這并不意味著其含量越高越好，Yvon[22]和Smit[6]等均發現當奶酪中支鏈醛的含量超過一定值時，可能會導致奶酪風味的不均衡，甚至產生令人不愉快的不良風味。因此，支鏈醛對奶酪風味的貢獻仍需進一步研究來確定。

2 3-甲基丁醛的合成途徑

奶酪中的3-甲基丁醛主要是由亮氨酸分解代謝產生的，包括兩個途徑：其一是亮氨酸在轉氨酶等的作用下分解代謝生成3-甲基丁醛，此途徑稱之為生物合成途徑；另一條途徑是亮氨酸通過化學降解生成3-甲基丁醛，此途徑稱之為Strecker降解途徑[8]。由于Strecker降解途徑需要在一定溫度下進行，所以這一降解過程在奶酪中比較緩慢，奶酪中3-甲基丁醛的產生以生物合成途徑為主，以Strecker途徑為輔。

2.1 生物合成途徑

奶酪中3-甲基丁醛的生物合成途徑見圖1。首先，亮氨酸在氨基轉移酶（aminotransferase，AT）的作用下將氨基轉移給α-酮戊二酸產生α-酮異己酸和谷氨酸，其中α-酮異己酸是亮氨酸分解代謝的中心產物[23]，谷氨酸在谷氨酸脫氫酶的作用下重新合成α-酮戊二酸作為氨基受體[24]。生成的α-酮異己酸通過兩種代謝途徑產生3-甲基丁醛：1）直接途徑，α-酮異己酸通過α-酮酸脫羧酶（α-ketoacid decarboxylase，KADC）的非氧化性脫羧作用產生3-甲基丁醛[25]，例如已經被發現的乳酸乳球菌IFPL730（Lactococcus lactisIFPL730）[26]和乳酸乳球菌乳脂亞種NIZO B1157[27]，就是利用直接途徑產生3-甲基丁醛；2）間接途徑，α-酮異己酸在α-酮酸脫氫酶（α-ketoacid dehydrogenase，KADH）的作用下生成異戊酰輔酶A，進一步通過磷酸轉移酶和酰基激酶生成異戊酸，最后在乙醛脫氫酶的作用下生成3-甲基丁醛[26]。已經被證實的利用間接途徑產3-甲基丁醛的菌有瑞士乳桿菌CNRZ 32（Lactobacillus helveticus CNRZ 32）[24]和丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）[28]。生成3-甲基丁醛的微生物包括乳酸菌，例如乳球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬和肉食桿菌屬，此外，一些酵母菌，例如漢斯德巴氏酵母、耶氏解脂酵母等作為附屬發酵劑也會促進奶酪中3-甲基丁醛的產生[12]。大部分微生物都是利用直接或者間接途徑生成3-甲基丁醛，然而值得注意的是，法國洛林Afzal等發現麥芽肉桿菌LMA 28[29]、Luo Jie等發現乳酸乳球菌乳酸亞種F9[30]均可以同時通過直接途徑和間接途徑兩種方式產生3-甲基丁醛。

圖1 3-甲基丁醛的生物合成機制[[8]]Fig. 1 Biosynthesis mechanism of 3-methylbutanal[8]

2.2 化學降解途徑（Strecker途徑）

從氨基酸到風味化合物的另一個重要化學反應是Strecker降解。通常，Strecker降解被描述為氨基酸的氨基與α-二羰基如還原糖的非酶、熱誘導的反應，并且它是美拉德反應中的重要步驟[31-32]。美拉德反應始于氨基與還原糖的縮合，形成所謂的Amadori產物。這種Amadori產物的重排可形成二羰基化合物。這種二羰基與氨基酸反應產生風味活性醛的過程稱為Strecker降解。然而，在高溫下，氨基酸的直接氧化脫羧也可產生相同的醛。這些反應在高溫下尤其強烈，因此在很大程度上決定了烘焙產品的風味。在較低溫度下，反應也會繼續進行，例如在奶酪和啤酒生產的情況下[33-34]。在亮氨酸存在的情況下，脫氨然后脫羧產生3-甲基丁醛，具體見圖2，溫度為主要控制參數，但底物濃度和底物特性也影響它們的轉化率；早在1957年，Keeney等[35]就已經假定這個反應可能會增加奶酪的風味，因為氨基酸和還原糖可以在合適的環境中獲得，而且長時間的成熟條件，使反應得以進行。

圖2 亮氨酸的Strecker降解途徑[[36]]Fig. 2 Strecker degradation pathway of leucine[36]

3 調控3-甲基丁醛合成的研究進展

鑒于3-甲基丁醛對奶酪風味的重要性，眾多研究者提出了一些調控3-甲基丁醛生物合成的策略，主要包括以下幾種。

3.1 添加附屬發酵劑

通過將篩選到的乳酸乳球菌和工業菌種混合作為附屬發酵劑進行切達的生產，3-甲基丁醛的含量可以顯著提高300～400 倍[37-38]；任發政教授團隊將乳酸乳球菌乳酸亞種F9用于切達奶酪的生產，發現通過高濃度的菌種添加可以顯著提高3-甲基丁醛的含量[30]；將漢遜德巴利酵母D18335（Debaryomyces hansenii D18335）添加到奶酪生產過程中，檢測到奶酪中3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和2-甲基丙醛的含量都顯著提高[39]。此外，添加能夠產生細菌素的菌株來誘導對細菌素敏感的發酵劑菌株發生裂解，使細胞內的酶釋放出來，使其與底物反應，也可以增加3-甲基丁醛的含量[40]。

3.2 添加前體物或輔因子

研究表明，通過添加3-甲基丁醛的前體物——亮氨酸，可以增加干酪凝乳中3-甲基丁醛的含量[36]；添加5-磷酸吡哆醛時，轉氨作用是氨基酸分解代謝的第一步，5-磷酸吡哆醛作為輔助因子用于催化轉氨酶的反應[41]，能夠催化亮氨酸產生α-酮異己酸；添加α-酮戊二酸時，在沒有外源添加α-酮戊二酸的情況下，奶酪中的氨基酸轉氨作用相當有限，因為α-酮戊二酸對于氨基酸轉氨過程來說是必須的。通過向奶酪凝乳中添加α-酮戊二酸可以原位刺激轉氨作用，主要導致α-酮異己酸和α-羥基異己酸的含量增加，α-酮異己酸又進一步地反應生成3-甲基丁醛[42-43]。van de Bunt等[44]在只有亮氨酸和乳酸乳球菌B1157（L. lactis strain 1157）的溶液中加入α-酮戊二酸后，3-甲基丁醛含量顯著增加。

3.3 基因工程手段

α-酮異己酸是亮氨酸分解代謝的中心物質，其除了可以通過直接和間接途徑生成3-甲基丁醛之外，還可以在α-羥基酸脫氫酶的氫化作用下產生α-羥基異己酸。但是根據文獻報道[23,29]，α-羥基異己酸是一種幾乎沒有任何風味的化合物，所以使編碼α-羥基酸脫氫酶的基因panE失活[45]，會減少可用于脫羧和其他轉化的α-酮異己酸的分解，以達到增加3-甲基丁醛含量的目的[46]。

3.4 改變物理化學條件

細胞外氧化還原電位或氧氣對風味的形成也能夠產生影響。通過增加溶解氧濃度或氧化劑，可以促進奶酪中所需醛/醇的形成，該調控方式已被許多研究證實[47-49]。

3.5 其他

乳酸乳球菌處于支鏈氨基酸（如異亮氨酸）饑餓狀態時，會導致3-甲基丁醛含量顯著升高[50-51]。支鏈氨基酸是全局調控因子CodY的效應分子，CodY通過與其結合，調控不同基因的轉錄，改變碳、氮代謝流的走向，幫助細胞適應營養匱乏的環境[52]。研究發現，在乳酸乳球菌中，CodY蛋白的結合位點是一個15 bp的回文序（AATTTTCNGAAAATT），稱為CodY-box[53]，在乳酸乳球菌的KADC基因的啟動子區域發現一個潛在的結合位點[46]。以上研究表明，全局調控因子CodY在3-甲基丁醛的生物合成調控中可能發揮著重要作用，然而其具體機制尚不明晰。

4 結 語

目前，雖然國內外對支鏈醛尤其是3-甲基丁醛對奶酪的風味貢獻及其生物合成有了一定的研究和了解，但仍然有許多問題有待解決。首先，香氣化合物在食品中的貢獻取決于多個因素：化合物的濃度、閾值、食品的基質以及不同化合物的相互作用[54]。盡管不同研究已經表明：合適濃度的3-甲基丁醛在奶酪中會產生令愉快的堅果風味，但是3-甲基丁醛對奶酪風味影響因素的指標尚未確定，包括3-甲基丁醛在奶酪中的閾值、合適的濃度范圍等。此外，Zhu Jiancai等[55]通過研究茶中風味物質的協同作用，發現3 種支鏈醛由于相似的結構和香韻特征表現出顯著的協同增效作用，然而這3 種支鏈醛之間，及其與其他化合物間對于奶酪堅果風味的協同作用鮮有研究。其次，盡管微生物生物合成3-甲基丁醛的兩種途徑已經明確，奶酪體系中哪種合成途徑更加有效、奶酪不同成熟時期關鍵酶的表達如何變化、存在兩種途徑的微生物在兩種途徑的選擇機制和分工配合關系如何等尚未完全揭示。近年來，基于多組學技術從多維度全面解析奶酪發生在微生物菌群、基因、蛋白、生化反應、風味產物等層次上的時序變化，并在此基礎上進行特定微生物的篩選和應用為這些問題提供了全面的解決方案[56]。這些問題的解決，對于如何選擇合適的附屬發酵劑、調控支鏈醛的合成非常重要。最后，如前所述，3-甲基丁醛一般在奶酪成熟6～9 個月開始產生，為了獲得更佳的堅果味的口感，往往需要很長的成熟時間。這不僅增加了產品的生產周期和成本，也不利于標準化的生產。盡管不同的研究者通過各種方式調控3-甲基丁醛的生成，但目前效果仍不明顯，一個可能的原因就是忽略了轉錄調控在其中發揮的重要作用。因而需要在前人的研究基礎上，解析3-甲基丁醛的合成和調控機制，為通過生物手段調控3-甲基丁醛的合成奠定基礎。

隨著人們營養健康意識的增強及西式快餐、烘焙食品的發展，喜歡奶酪的人會越來越多，奶酪將成為我國乳制品行業中最具成長潛力的品類之一。鑒于口味是消費者選擇食品的重要因素，開發適合中國口味的奶酪便成為提高國內奶酪消費、促進國內奶酪產業發展的關鍵。因此，開發并生產強化堅果風味的奶酪具有很大的發展空間和潛力。3-甲基丁醛是奶酪成熟過程中產生的特征風味物質，對奶酪堅果風味的形成具有重要影響。因此，通過全面研究3-甲基丁醛對奶酪堅果風味的貢獻，闡明支鏈醛對于奶酪風味的貢獻及奶酪堅果味的形成機制，對于開發生產更適合我國消費者口味的奶酪，促進我國原制奶酪產業的轉型和升級具有重要的意義。