冰水混合物結合溶菌酶對菠菜品質及硝酸鹽含量的影響

李翠紅，魏麗娟，慕鈺文，馮毓琴*

（甘肅省農業科學院農產品貯藏加工研究所，甘肅省果蔬貯藏加工技術創新中心，甘肅 蘭州 730070）

甘肅省是蔬菜大省，主要以高原露地夏菜為主，6—9月份上市，由于海拔高、氣候冷涼、光照充足等特點，蔬菜色澤好、營養豐富，具有明顯的品質優勢，主要銷往沿海以及東南亞等80多個大中城市，很好地填補了我國東部及南方蔬菜“伏缺”季節的市場供應，形成了富有地域特色的“高原夏菜”品牌，是全國重要的高原夏菜和西菜東調基地[1]。夏菠菜是甘肅高原夏菜的主要蔬菜品種，其富含類胡蘿卜素、VC，色澤好、營養豐富，具有明顯的品質優勢。而高原夏菜采收期正值高溫炎熱季節，較春秋蔬菜采后更易黃化和腐爛，積累亞硝酸鹽，尤其貯藏條件不當時，甚至會引起數倍或數百倍的累積[2]。因而菠菜的采后保鮮是生產實踐中亟需解決的難題。

冰水混合物（0 ℃）處理作為一種蔬菜的物理保鮮手段，是將新鮮的蔬菜放入冰水體積比例為1∶1的混合物中浸泡，使蔬菜的溫度瞬間達到0 ℃，降溫速率快，使蔬菜的呼吸作用很快降到最低，是一種安全、綠色的保鮮手段。臭氧作為一種強氧化劑，具有良好的殺菌防腐作用且無殘留，在食品行業得到廣泛的應用[3]。Feliziani等[4]對冷藏（2 ℃）期間的鮮食葡萄采用低質量濃度（0.075～0.500 mg/L）持續的臭氧處理，結果表明，低質量濃度持續的臭氧處理可以抑制受感染果對健康果粒的侵染；李珍等[5]選用間歇式臭氧處理冰溫條件下貯藏的紅提葡萄，結果表明，隨著貯藏時間的延長，臭氧處理降低了紅提葡萄的腐爛率、落粒率，能有效保持好果率，延緩葡萄果實的衰老和品質劣變，減緩由質量損失引起的新鮮度下降。王瑾等[6]研究發現采用高濃度臭氧水保鮮鮮切花椰菜利大于弊，所以在鮮切花椰菜的加工工藝中宜采用高濃度臭氧水短時間的處理方案。Selma等[7]用不同濃度的臭氧水處理鮮切萵筍，結果表明，5.4 μL/L的臭氧水殺菌效果最好。

溶菌酶是一種能水解細胞壁肽聚糖的比較穩定的堿性蛋白酶，主要通過切斷細胞壁肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4-糖苷鍵[8]，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂，細菌裂解。已有報道稱，T4溶菌酶因具有兩親性質的C端，可以直接干擾細菌、真菌和植物細胞的膜活性，進而抑制微生物生長，并非通過溶解細胞壁發揮抑菌活性[9]。溶菌酶作為抗微生物藥物具有良好的生物相容性，至今未出現耐藥現象[10-11]。已有許多將溶菌酶應用于水產品防腐保鮮中的研究，Hikima等[12]通過對日本對蝦的C型溶菌酶的研究證實，該溶菌酶對多種弧菌及魚類的病原菌具有不同程度的殺菌作用。De-la-re-vega等[13]利用溶菌酶保鮮液對南美白對蝦進行研究，實驗表明，溶菌酶保鮮液抑制弧菌屬生長的效果與抑制滕黃微球菌的效果相當。也有研究將溶菌酶與保鮮劑以及保鮮技術相結合，?zogul等[14]利用真空包裝和氣調包裝（modified atmosphere packaging，MAP）對沙丁魚進行包裝，得出MAP比真空包裝沙丁魚的貨架期延長3 d，并且MAP中的細菌繁殖要緩慢得多，進一步證實了MAP技術的價值。Fernández等[15]將溶菌酶與氣調包裝結合，使大西洋鮭魚片的貨架期延長。溶菌酶在果蔬的保鮮中也有一定的應用。張迪等[16]研究1-甲基環丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）結合溶菌酶處理對蘋果保鮮效果的影響，結果表明，1.5 μL/L 1-MCP和質量分數0.08%溶菌酶處理能有效提高蘋果的商品品質。周林宗等[17]利用溶菌酶、海藻酸鈉和殼聚糖復配保鮮液對油桃進行保鮮處理，結果發現含質量分數1%的殼聚糖、0.07%的溶菌酶和1%的海藻酸鈉的復配保鮮液對油桃保鮮效果最好，能有效延緩質量損失率的上升及可溶性糖、VC含量的下降，降低了果實腐爛指數及呼吸強度。范林林[18]研究了熱處理、檸檬酸、溶菌酶、D-異抗壞血酸鈉、殼聚糖等處理對鮮切寒富蘋果的保鮮防腐效果，結果表明，溶菌酶處理能有效維持鮮切蘋果的外觀品質，抑制相對電導率、丙二醛含量、多酚氧化酶活性及菌落總數的增加，顯著維持了過氧化物酶（peroxidase，POD）活性，質量分數0.08%溶菌酶保鮮效果最佳。溶菌酶在蔬菜防腐保鮮中的應用研究鮮見報道，本實驗通過溶菌酶結合冰水混合物處理、臭氧水處理及溶菌酶處理3 種方法對新鮮菠菜進行處理，研究不同處理方法對菠菜貯藏期品質及硝酸鹽含量的影響，以選出適合菠菜保鮮的方法，為減少化學保鮮劑的應用，開發簡便、安全的菠菜貯藏保鮮技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用新鮮的夏菠菜采自高原夏菜主產區蘭州市永登縣龍泉鎮，挑選長勢均勻一致的菠菜，早上7點取樣，樣品取好后裝入泡沫箱內及時拉回放入冷庫進行處理。

溶菌酶 上海源葉生物科技有限公司；α-淀粉酶、蛋白酶、大鼠血清 諾維信（中國）生物技術有限公司；甲醇（色譜級）、磷酸二氫鉀、β-巰基乙醇、抗壞血酸 美國賽默飛世爾科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

WSC-S色差計 上海精密儀器儀表有限公司；SQP型電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；Cary-100型紫外-可見分光光度計、1200高效液相色譜儀美國安捷倫科技有限公司；TGL-16M臺式離心機 湘南星科科學儀器有限公司；HH-S6型電熱恒溫水浴鍋北京科偉永興儀器有限公司；HY-019-200A臭氧發生器廣州佳環電器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菠菜處理

本次實驗所用的臭氧發生器開機0.5 h后，臭氧水中臭氧質量濃度穩定在3 mg/L左右，用臭氧水與水按比例混合得到2.3 mg/L的臭氧水。將挑選的菠菜放置在白色小塑料筐中，每筐500 g左右。按以下分組進行相應處理：第1組，常溫蒸餾水處理，作為CK組；第2組，質量濃度為1 g/L溶菌酶處理；第3組，2.3 mg/L的臭氧水處理（根據本課題前期臭氧水在葉菜類最佳保鮮質量濃度確定）；第4組，將1 g的溶菌酶溶解到冰水體積比為1∶1的總體積為1 000 mL的冰水中，配成溶菌酶質量濃度為1 g/L的冰水混合物，作為冰水+溶菌酶處理組。將菠菜分別放入以上4 組處理液中浸泡10 min，自然風干后，裝入27 cm×19 cm×20 cm聚丙烯密閉箱內，放入4 ℃的生化培養箱，設3 組平行，每2 d取樣，所取樣品放入－26 ℃內保存，進行各指標的測定。

1.3.2 色澤的測定

將處理好的貯藏期的菠菜，每個處理選取3 株，標記同一塊葉片，用于菠菜色亮度L*值、紅綠度a*值和黃藍度b*值的測量，分別按照公式（1）、（2）計算色差ΔE和色調角H值。

式中：ΔL*、Δa*、Δb*分別表示樣品測定值與鮮樣差值；H值變化范圍在0°～180°之間，顏色變化依次為紫紅、紅、橙紅、橙、黃、黃綠、綠和藍綠，當H＝0°時為紫紅色；H＝90°時為黃色；H＝180°時為綠色；H＞100°時，H值越大，果實綠色越深；H＜50°時，H值越小，果實紅色越深。

1.3.3 葉綠素、VC含量的測定

參照NY/T 3082—2017《水果、蔬菜及其制品中葉綠素含量的測定 分光光度法》[19]，使用分光光度法測定葉綠素的含量。

VC含量采用2,6-二氯靛酚滴定法測定。

1.3.4 可溶性糖質量分數、可溶性蛋白含量的測定

可溶性糖質量分數采用蒽酮比色法[20]；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法[21]。

1.3.5 葉酸含量的測定

菠菜中葉酸的提取參考孟繁磊等[22]的三酶法。稱取粉碎后菠菜樣品0.2 g于2 mL離心管中，加入750 μL磷酸鹽緩沖溶液（含質量分數1%抗壞血酸鈉鹽和0.1% β-巰基乙醇），95 ℃水浴孵育15 min后于冰上冷卻，之后加入5 mm鋼珠，在組織研磨機中14 000r/min研磨樣品5 min。勻漿液中加入750 μL上述磷酸鹽緩沖溶液和適量α-淀粉酶，靜置10 min，加入適量蛋白酶，37 ℃培養1 h；100 ℃煮沸10 min；冰上冷卻后在4 ℃、14 000 r/min離心10 min；吸取上清液，在上清液中加入適量大鼠血清，混勻后，于37 ℃培養2 h；100 ℃煮沸滅活10 min，冰上冷卻1 h后4 ℃、4 000 r/min離心15 min，所得上清液即為葉酸提取液；吸取上清液分裝于滅菌管中直接測定或凍存于－80 ℃。樣品提取過程均需在避光下操作。

葉酸含量測定采用高效液相色譜法，色譜條件：流動相為0.01 mol/L KH2PO4-CH3OH溶液（體積比為89∶11，pH 6.3）；柱溫25 ℃；流速為1.0 mL/min；進樣量為20 μL；紫外檢測波長280 nm；C18色譜柱（4.6 nm×150 nm，5 μm）。

1.3.6 草酸含量的測定

草酸含量測定參照曾芳等[23]的分光光度法。取0.5 g樣品，在液氮中迅速研磨至粉末狀，加入0.5 mL蒸餾水轉移至10 mL離心管，70 ℃水浴加熱30 min，并搖動數次。取出后冷卻過濾，取濾液2 mL，分別加入2 mL 0.5 mg/mL FeCl3溶液、20 mL 0.2 mol/L pH 2 的KCl緩沖液、1.2 mL質量分數0.5%的磺基水楊酸，并用蒸餾水將體系定容至25 mL。顯色30 min后，以蒸餾水為參比，在510 nm波長處測定吸光度，并計算樣品中的草酸含量。

1.3.7 硝酸鹽、亞硝酸鹽含量和硝酸還原酶、POD活力的測定

硝酸鹽含量的測定參考GB 5009.33—2016《食品國家安全標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的紫外分光光度法[24]；亞硝酸鹽含量采用鹽酸萘乙二胺法[25]測定。

硝酸還原酶活力的測定：取4 份1 g菠菜樣品剪碎混勻，剪成1 cm左右小段，放于塑料離心管中。其中1 份做對照，另外3 份做酶活力測定。在對照管預先加入1 mL、質量分數30%三氯乙酸，然后在各管中都加入9 mL 0.1 mol/L KNO3溶液。混勻后立即放入真空干燥培養箱內，抽真空1 min，再通氣，反復3 次以上以便排出組織間隙的氣體，使底物進入組織。最后通入氮氣密封后，并在25 ℃黑暗中反應0.5 h，再分別向測定管加入1 mL、質量分數30%三氯乙酸，以終止酶反應。吸取2 mL反應液，加入1 mL、質量分數1%磺胺和1 mL、質量分數1%的a-萘胺顯色15 min后，4 000 r/min離心5 min，取上清液于540 nm波長處測定其吸光度。硝酸還原酶活力以每克鮮質量樣品每小時產生NO2－的質量計，單位為μg/（g·h）。

POD活力參考Zhang Yongfu等[26]的方法。

1.4 數據統計與分析

所有實驗在取樣時進行3 次生物學重復，指標測定時進行3 次技術重復，實驗結果表示為平均值±標準差。所有數據利用Origin 8.5軟件進行整理并作圖。通過SPSS 19軟件的Duncan’s多重比較法分析差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 菠菜貯藏期間的色澤變化

表1 不同處理對菠菜貯藏期間色澤的影響Table 1 Effect of different treatments on color parameters of spinach during storage

葉片的顏色直接影響菠菜的感官品質。由表1可知，4 個處理中，冰水+溶菌酶處理組的平均L*、a*和b*值顯著低于其他3 個處理組，H值顯著大于其他3 個處理組，平均ΔE分別比1 g/L溶菌酶、2.3 mg/L臭氧水及CK組高14%、17%和30%。這說明冰水+溶菌酶處理的菠菜在貯藏期葉片最綠，亮度最亮，因此與其他處理方式相比，冰水+溶菌酶處理能顯著保持菠菜貯藏期的色澤，延長其貨架期。

2.2 菠菜貯藏期葉綠素、VC含量的變化

圖1 菠菜貯藏期間葉綠素（A）、VC（B）含量的變化Fig. 1 Changes in chlorophyll (A) and VC (B) contents in spinach during storage

葉綠素作為分布最廣泛的色素直接影響綠色蔬菜的顏色品質。由圖1A可知，葉綠素含量在整個貯藏期間呈下降趨勢；CK組在整個貯藏期間葉綠素含量下降速率最快，而1 g/L溶菌酶和臭氧水組之間差異不顯著，溶菌酶+冰水組在整個貯藏期間葉綠素含量顯著高于其他處理組（P＜0.05）；貯藏第8天時，CK組的葉綠素含量比冰水+溶菌酶組低66%，這說明溶菌酶+冰水處理能有效延緩菠菜貯藏期間的黃化速率。

VC在菠菜貯藏過程中易被氧化破壞，其含量可作為衡量菠菜營養價值的重要指標。由圖1B可知，VC含量的變化趨勢與葉綠素含量變化一致，都呈下降趨勢，除CK組外，其他3 個處理組貯藏前4 d的VC含量無顯著差異，在貯藏的4～8 d，溶菌酶+冰水組的VC含量顯著高于其他3 個處理組，且在貯藏第10天時，CK組的VC含量比冰水+溶菌酶組低35%。這是因為冰水處理能使菠菜的溫度迅速降到0 ℃，使菠菜的氧化速率顯著降低，VC不易被氧化破壞。

2.3 菠菜貯藏期間可溶性糖質量分數、可溶性蛋白含量的變化

圖2 菠菜貯藏期間可溶性糖質量分數（A）、可溶性蛋白含量（B）的變化Fig. 2 Changes in soluble sugar (A) and soluble protein (B) contents in spinach during storage

由圖2A可知，可溶性糖質量分數在整個貯藏期間呈現先增后減的趨勢，前4 d，各處理組的可溶性糖質量分數無顯著差異，從第4天開始，溶菌酶+冰水組的可溶性糖質量分數顯著高于其他3 個處理組，且在貯藏第6天時比CK組高52%，說明溶菌酶+冰水處理能抑制菠菜貯藏期間可溶性糖質量分數的下降。可溶性糖是蔬菜中的一種重要營養物質，相關研究認為蔬菜中可溶性糖含量在常溫貯藏條件下先升高再降低，呈上升趨勢是因為在酶的作用下，淀粉等多糖類水解，后期在微生物分解下可溶性糖含量下降[27-29]，與本實驗結果基本一致。

可溶性蛋白含量是衡量植物適應逆境環境情況的一個重要指標，能反映植物體的代謝強度，可溶性蛋白在參與新器官形成的同時，可直接調控參與各種生化反應的酶[30]。由圖2B可知，整個貯藏期間可溶性蛋白含量呈現先升高后降低的趨勢，前期增加是由于各組低溫貯藏的菠菜對逆境具有抵抗力，能通過保護自身細胞維持代謝能力，在貯藏后期，菠菜可能因為失水、腐爛，組織開始衰老，保護能力降低，可溶性蛋白含量降低。從增長趨勢來看，冰水+溶菌酶組從貯藏第4天開始可溶性蛋白含量顯著高于其他3 組（P＜0.05）；這說明，冰水+溶菌酶處理能使菠菜在貯藏期間維持較低的代謝水平。

2.4 菠菜貯藏期間葉酸、草酸含量的變化

圖3 菠菜貯藏期間葉酸（A）、草酸（B）含量的變化Fig. 3 Changes in folic acid (A) and oxalic acid (B) contents in spinach during storage

菠菜中含有豐富的葉酸，但葉酸會隨著貯藏時間延長不斷損失。由圖3A可知，在整個貯藏期間，葉酸含量均呈下降趨勢，貯藏到第10天時，CK組的損失率最高，為49%，其次是1 g/L溶菌酶和臭氧水組，分別為34%、40%，冰水+溶菌酶組在整個貯藏期間葉酸含量損失最低，損失率僅為25%。由此可見，冰水+溶菌酶能明顯抑制菠菜貯藏過程中葉酸含量的下降。

菠菜含有的大量草酸被認是一種抗營養物質和有毒物質[31-32]。由圖3B可知，草酸含量隨著貯藏時間的延長呈現不斷增長的趨勢，貯藏第10天時，CK組草酸含量最高，與0 d相比提高了1.6 倍，其次是1 g/L溶菌酶和臭氧水組，分別提高了1.4、1.3 倍，而冰水+溶菌酶組僅提高59%。由此可見，冰水+溶菌酶可抑制菠菜貯藏過程中草酸含量的上升。

2.5 菠菜貯藏期間硝酸鹽、亞硝酸鹽含量的變化

圖4 貯藏期間菠菜硝酸鹽（A）、亞硝酸鹽（B）含量的變化Fig. 4 Changesin nitrate (A) and nitrite (B) contents in spinach during storage

由圖4A可知，在整個貯藏期間，4 組菠菜硝酸鹽含量隨貯藏時間的延長呈現先快速上升后稍下降，再上升或平穩的基本趨勢。從總體上看，前4 d變化幅度較大，第2天含量達到最大，CK組含量變化最明顯，冰水+溶菌酶組變化最小。總體來看，在整個貯藏期間，冰水+溶菌酶組硝酸鹽含量都顯著低于其他3 組（P＜0.05），尤其在第2、4、8天最明顯，并且始終保持較低水平。

由圖4B可知，隨著貯藏時間的延長，4 組亞硝酸鹽含量呈上升-下降-上升的趨勢。第2天達到峰值，隨后開始下降，到第6天后又開始上升；第8天時，冰水+溶菌酶組亞硝酸鹽含量為1.49 mg/kg，較CK組低31%。總體來看，CK組亞硝酸鹽含量始終高于其他3 個處理組，而冰水+溶菌酶組在整個貯藏期間都顯著低于其他3 組。

2.6 菠菜貯藏期間硝酸還原酶、POD活力的變化

圖5 菠菜貯藏期間硝酸還原酶（A）、POD（B）活力的變化Fig. 5 Changes in NR (A) and POD (B) activity in spinach during storage

由圖5A可知，菠菜硝酸還原酶活力隨著貯藏時間的延長而下降，剛采收的菠菜具有很高的硝酸還原酶活力，但貯藏至第2天時，CK組的硝酸還原酶活力與初始（0 d）相比降低34%，而冰水+溶菌酶組僅降低5.2%，兩者差異極顯著（P＜0.01）。總體來看，冰水+溶菌酶處理能顯著抑制硝酸還原酶活力的下降，而硝酸還原酶能催化硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，因此從理論上講，生成的亞硝酸鹽總量大于CK組，而本實驗中亞硝酸鹽累積量較CK組低，這是因為冰水+溶菌酶處理不但提高了硝酸還原酶的活力，同時還可能協同提高了亞硝酸還原酶的活力，使亞硝酸鹽（NO2－）較快地合成NH4+，從而使亞硝酸鹽的累積總量處于較低的水平。

POD是植物體內抵御活性氧傷害的重要酶類，POD對減少活性氧積累、抵御膜脂過氧化和維護膜結構的完整性有重要作用[33-34]。由圖5B可知，剛采摘的菠菜POD活力較低，在貯藏期間，CK組和3 個處理組的POD活力總體變化趨勢一致，均呈現先增后降的趨勢。所有組在貯藏第2天時POD活力達到最大值，之后，隨著貯藏時間的延長，POD活力開始下降，且冰水+溶菌酶處理組POD活力顯著高于CK組（P＜0.05）。這說明在貯藏期間，冰水+溶菌酶、溶菌酶和臭氧水處理都能在一定貯藏時間內提高菠菜POD的活力，延緩其衰老，但冰水和溶菌酶結合保鮮效果最好。

3 結 論

本實驗以甘肅高原夏菜的代表性蔬菜——菠菜為材料，研究常溫水、1 g/L溶菌酶、2.3 mg/L臭氧水及冰水混合物結合溶菌酶4 種處理對菠菜貯藏期間品質及硝酸鹽含量的影響。結果發現，與其他處理相比，冰水+溶菌酶處理能使菠菜保持較高VC、葉綠素、可溶性蛋白、葉酸含量和可溶性糖質量分數及硝酸還原酶和POD活力，減緩草酸、硝酸鹽、亞硝酸鹽的形成，從而可延緩菠菜貯藏期間的衰老，提高菠菜貯藏品質。