表面糊化處理確定乙酰化羥丙基小麥淀粉中取代基團(tuán)分布

趙 凱，劉 寧，李 君，雷 鳴，陳 威，楊春華，陳鳳蓮

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076）

小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要的糧食作物，廣泛種植于華北及東北地區(qū)。淀粉是小麥中含量最高的組分，占70%以上，對(duì)小麥粉的加工及貯藏品質(zhì)具有重要影響。為了改善小麥淀粉的加工品質(zhì)，拓展其應(yīng)用范圍，經(jīng)常采用酯化及醚化進(jìn)行改性處理，制備乙酰化（醋酸酯）小麥淀粉、羥丙基化小麥淀粉[1-3]。這些接入的具有空間位阻作用的基團(tuán)能提高淀粉親水特性，降低淀粉的糊化溫度，改善淀粉的凍融穩(wěn)定性及淀粉糊的透明度[4]。目前，業(yè)內(nèi)一般采用取代度來評(píng)價(jià)酯化及醚化淀粉的改性程度[5]，但是取代度僅能從量上反映取代程度，具體取代基團(tuán)在淀粉顆粒內(nèi)如何分布，是從淀粉表面到顆粒內(nèi)部均勻分布還是集中在某一區(qū)域，通過取代度還無法做出判斷。如果想了解取代基團(tuán)在顆粒內(nèi)的分布情況，可采用表面糊化技術(shù)從淀粉表面到內(nèi)部逐層糊化淀粉顆粒，一般選用高濃度的氯化鈣或氯化鋰，通過化學(xué)糊化的方法對(duì)淀粉顆粒實(shí)現(xiàn)逐層剝離、控制糊化程度，進(jìn)而分析表面糊化的淀粉和剩余淀粉顆粒內(nèi)取代基團(tuán)的含量，來確定反應(yīng)發(fā)生在表面還是顆粒內(nèi)部[6-7]。Jane等采用表面糊化技術(shù)分析直鏈淀粉在馬鈴薯淀粉顆粒內(nèi)的分布，結(jié)果表明，直鏈淀粉主要分布在淀粉顆粒的表面，尤其是短直鏈淀粉，而鏈長(zhǎng)較長(zhǎng)的直鏈淀粉則伸展到顆粒內(nèi)部[8]。Kuakpetoon等采用表面糊化技術(shù)研究了玉米淀粉顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明直鏈淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物主要集中在顆粒表層[9-10]。Huang Junrong等研究了乙酰基在乙酰化（醋酸酯）淀粉顆粒內(nèi)取代基的分布[11]。Li Lingjin等研究了酸水解羥丙基復(fù)合改性馬鈴薯淀粉顆粒結(jié)構(gòu)及流變學(xué)特性的影響，揭示出淀粉經(jīng)酸水解處理后可提高羥丙基淀粉取代度[12]。而對(duì)于乙酰化羥丙基復(fù)合改性處理過程中取代基團(tuán)在淀粉顆粒內(nèi)的分布及表面糊化處理后淀粉分子質(zhì)量分布的變化，則國(guó)內(nèi)外研究較少。

本實(shí)驗(yàn)采用表面糊化法研究單一及復(fù)合改性條件下取代基團(tuán)在淀粉顆粒內(nèi)的分布，進(jìn)而研究表面糊化處理后淀粉的顆粒特性、分子質(zhì)量的變化以及直鏈淀粉的含量與分布，以期為改性淀粉在食品工業(yè)中的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥淀粉 青島百樂麥?zhǔn)称酚邢薰荆恍←溈偟矸邸⑿←淎淀粉、小麥B淀粉、羥丙基淀粉、乙酰化（醋酸酯）淀粉、乙酰化羥丙基淀粉由哈爾濱商業(yè)大學(xué)省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制；瓊脂糖凝膠CL-2B瑞典Pharmacia LKB公司；濃硫酸、苯酚、水合茚三酮、亞硫酸氫鈉、硫酸鈉、氫氧化鈉、環(huán)氧丙烷、醋酸酐、鹽酸、酚酞、疊氮鈉、無水乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VersaMax酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；ALC-2100電子分析天平 上海精密儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州市亞榮儀器有限公司；TDL-5-A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG-9420A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FW80-I高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯有限公司；SU8000掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；SBS-160F自動(dòng)部分收集器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥淀粉不同組分分離

參考文獻(xiàn)[13-14]對(duì)小麥淀粉不同組分進(jìn)行分離。

1.3.2 乙酰化淀粉、羥丙基淀粉及乙酰化羥丙基復(fù)合改性淀粉的制備

參考文獻(xiàn)[15-18]對(duì)乙酰化淀粉、羥丙基淀粉及乙酰化羥丙基復(fù)合改性淀粉進(jìn)行制備。

1.3.3 表面糊化淀粉的制備

精確稱量小麥淀粉7.5 g，懸浮于17.5 mL 4 mol/L的無水氯化鈣中，在溫度為21 ℃的磁力攪拌器中160～200 r/min攪拌一定時(shí)間，加入0 ℃冰水混合物后，8 000 r/min離心20 min，棄上清液，將沉淀用1 L蒸餾水洗滌15～25 min，去除殘留氯化鈣后離心[8,19]。

1.3.4 淀粉糊化率的測(cè)定

將處理后的淀粉懸浮于200 mL蒸餾水中，高速（960～1 000 r/min）攪拌10 min，此過程重復(fù)5 次，靜置30 min，小心倒出上清液， 分離糊化淀粉。重新注入200 mL蒸餾水，將上述過程重復(fù)一次。沉淀用無水乙醇洗滌2 次，離心，然后將其放入40 ℃的烘箱中干燥，上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除水分后，用10 倍體積無水乙醇洗滌，8 000 r/min離心30 min后收集糊化淀粉，無水乙醇洗滌2 次后于40 ℃的烘箱中干燥[8,19]。按下式計(jì)算淀粉糊化率。

1.3.5 取代度測(cè)定

參考文獻(xiàn)[20-21]測(cè)定取代度。

1.3.6 凝膠滲透色譜測(cè)定分子質(zhì)量分布

參考文獻(xiàn)[22]，采用凝膠滲透色譜測(cè)定分子質(zhì)量分布。

1.3.7 總糖含量的測(cè)定

通過苯酚-硫酸法進(jìn)行總糖含量的測(cè)定，取1 mL樣品（含總糖10～100 μg）加入1 mL體積分?jǐn)?shù)5%的苯酚溶液，混合，加入5 mL濃硫酸后混合均勻，置于室溫保持20～30 min，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[23]。

1.3.8 淀粉藍(lán)值測(cè)定

取200 μL樣品注入96 孔酶標(biāo)板，加入200 μL碘溶液，混合，使用VersaMax酶標(biāo)儀在630 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[23]。

1.3.9 直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

根據(jù)凝膠滲透色譜圖，利用面積法計(jì)算出直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)[23]。

1.3.10 淀粉顆粒形貌分析

利用SU8000掃描電子顯微鏡，將待測(cè)樣品用雙面膠固定在樣品臺(tái)上，采取離子濺射法在樣品的表面鍍金。分析條件為：噴金180 s，電流20 mA。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Origin 9.0軟件處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥淀粉顆粒形貌分析結(jié)果

圖1 表面糊化處理前后小麥淀粉顆粒形貌Fig. 1 Granule morphology of the wheat starches before and after surface gelatinization

圖1 A～C分別為小麥總淀粉及小麥A淀粉、B淀粉的掃描電子顯微鏡照片，可以看出小麥A淀粉的顆粒呈圓盤形、扁球形，顆粒表面比較光滑，無明顯孔洞及破損；B淀粉形狀并不均勻一致，其不完整程度和邊緣破損程度均較A淀粉高，B淀粉顆粒間有團(tuán)聚現(xiàn)象，在數(shù)量上明顯多于A淀粉，這與文獻(xiàn)[24-26]觀察到的結(jié)果一致。圖1D～E為表面糊化處理30、45 min后剩余A淀粉顆粒，外層糊化淀粉移除后顆粒大小有所減小，且表面較為粗糙，有明顯的剝蝕現(xiàn)象，這表明氯化鈣溶液主要作用于淀粉顆粒表層，糊化后在機(jī)械力作用下，淀粉從表層脫落，剩余淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)仍被保留。圖1F為表面糊化處理后表層剝離的糊化淀粉，可以看到這部分淀粉已經(jīng)完全失去顆粒結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)不規(guī)則形狀。

2.2 小麥淀粉分子質(zhì)量分布分析結(jié)果

凝膠滲透色譜法不但能應(yīng)用于不同組分的分離與鑒定，還可用來分析化學(xué)性質(zhì)相同但分子體積不同的高分子同系物。一般按照淀粉分子流出凝膠柱的先后順序?qū)⒌矸鄣慕M成分為高分子質(zhì)量級(jí)分、中間級(jí)分和低分子質(zhì)量級(jí)分；前者主要為支鏈淀粉，其峰形尖銳，相對(duì)分子質(zhì)量分布相對(duì)較為集中；后者為直鏈淀粉，由許多不同聚合度的直鏈分子組成，多呈現(xiàn)連續(xù)分布的狀態(tài)；而中間級(jí)分分布有時(shí)不是十分明顯，它主要包括了支化度較低的支鏈淀粉和糊精[27]。

圖2 小麥淀粉及其改性淀粉的滲透凝膠色譜圖Fig. 2 Gel permeation chromatograms of the native and modified wheat starch

由圖2可見，凝膠色譜圖呈連續(xù)分布狀態(tài)，主要由直鏈淀粉與支鏈淀粉兩個(gè)部分組成，其中支鏈淀粉分子摩爾質(zhì)量較大，約在幾百萬到幾億g/mol，所以先被洗脫出來；直鏈淀粉分子摩爾質(zhì)量較小，約在幾萬至幾百萬g/mol，所以后被洗脫出來[28-29]。由圖2可以看出，淀粉改性前后分子質(zhì)量的大小與分布發(fā)生了較大變化，原淀粉（圖2A～C）的分子質(zhì)量分布相對(duì)集中，支鏈淀粉的分子質(zhì)量很大，峰形高且尖銳；直鏈淀粉峰較寬但高度低，這表明直鏈淀粉分子是由很多聚合度不同的直鏈淀粉分子組成，其聚合度呈連續(xù)分布。而改性淀粉（圖2D～H）的尖峰位置相較于原淀粉均出現(xiàn)推移的現(xiàn)象。由此可說明，隨著酯化反應(yīng)的進(jìn)行，淀粉的支鏈發(fā)生一定程度裂解，逐漸斷裂成支化度更小的分子。此外，改性淀粉的分子質(zhì)量分布范圍逐漸變寬，由凝膠排阻色譜圖可以看出，醋酸酐添加量越多取代度越大，對(duì)于淀粉分子質(zhì)量分布影響也越大。高取代度下，改性淀粉分子質(zhì)量下降愈加明顯，意味著淀粉分子降解程度提高。此外，乙酰化羥丙基復(fù)合改性淀粉（圖2G～H）先醚化再酯化，其中環(huán)氧丙烷及醋酸酐對(duì)于乙酰化羥丙基淀粉的分子質(zhì)量分布影響較大，原料羥丙基淀粉，摩爾取代度是0.13，經(jīng)乙酰化后分子質(zhì)量分布依然較寬，藍(lán)值明顯增加，可能是因?yàn)樵谥苽溥^程中要以酸為試劑，在加熱條件下，部分長(zhǎng)支鏈淀粉降解，斷裂成不同分子質(zhì)量的短鏈淀粉所導(dǎo)致。所以制備乙酰化羥丙基淀粉的分子質(zhì)量分布也較寬，分子質(zhì)量也有所降低。

2.3 表面糊化處理后小麥淀粉分子質(zhì)量分布分析結(jié)果

圖3 表面糊化處理前后小麥淀粉及乙酰化小麥A淀粉凝膠滲透色譜Fig. 3 Gel permeation chromatograms of the native and modified wheat starches before and after surface gelatinization

由圖3可以看出，不論是原淀粉還是改性淀粉，經(jīng)表面糊化處理后剩余淀粉的藍(lán)值都顯著下降，表面糊化處理時(shí)間越長(zhǎng)，高分子質(zhì)量的淀粉分子被去除越多，所以藍(lán)值逐漸降低。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，支鏈淀粉分子質(zhì)量也逐漸降低，可能是淀粉經(jīng)表面糊化處理后部分的支鏈淀粉被移除或降解，后者斷裂成不同分子質(zhì)量的短直鏈淀粉所致；且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)其藍(lán)值下降愈加明顯；其次，與原淀粉相比，表面糊化處理后剩余淀粉的藍(lán)值彌散性顯著增大。小麥A淀粉及乙酰化A淀粉經(jīng)表面糊化處理后剩余淀粉的總糖含量下降顯著，這與Jane[8]和Granza[18]等的研究規(guī)律一致。

2.4 表面糊化前后小麥淀粉不同組分直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與 糊化率分析結(jié)果

表1 表面糊化前后小麥淀粉不同組分直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)及糊化率Table 1 Amylose content and gelatinization degree of the wheat starches before and after surface gelatinization

從表1中可以看出，小麥淀粉各組分經(jīng)表面糊化處理后直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)，并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低；在表面糊化處理30 min后，直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（24.10±0.12）%，下降的速率較快，隨后減慢；其次，小麥淀粉各組分經(jīng)表面糊化處理后，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)糊化度呈上升趨勢(shì)。由表1可知，剩余小麥A淀粉的直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)要高于剩余小麥B淀粉的，證明隨著顆粒增大其直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，這與Jane[8]、Kuakpetoon[10]和Pan Daodong[19]等之前的報(bào)道一致。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明直鏈淀粉更集中于淀粉顆粒外層，且剩余淀粉有一個(gè)較低的直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，也證明了CaCl2處理發(fā)生在淀粉的外層。

2.5 表面糊化處理單一及復(fù)合改性淀粉取代度變化分析結(jié)果

由圖4可知，乙酰化小麥B淀粉的取代度高于相應(yīng)的乙酰化小麥A淀粉。這是因?yàn)榕c大顆粒淀粉相比，小顆粒淀粉的比表面積更大，表面的羥基更多，和乙酸酐反應(yīng)的羥基基團(tuán)也更多。單一改性及復(fù)合改性的淀粉經(jīng)表面糊化處理后，乙酰化小麥總淀粉剩余淀粉（CaCl2處理30、45、60 min）的取代度分別為0.049、0.035及0.021，羥丙基小麥總淀粉剩余淀粉取代度分別為0.109、 0.087及0.062，乙酰化羥丙基小麥總淀粉剩余淀粉取代度分別為0.05、0.04及0.02。從以上數(shù)據(jù)可以看出，隨著表面糊化處理時(shí)間的延長(zhǎng)，剩余淀粉顆粒的取代度呈下降趨勢(shì)。表面糊化處理后外層糊化的程度越高，所獲得的剩余淀粉顆粒取代度就越小，表明乙酰化基團(tuán)的取代反應(yīng)主要在淀粉顆粒的外層發(fā)生，淀粉顆粒中心部位的乙酰基含量均較低，說明顆粒內(nèi)部發(fā)生取代的概率小。因?yàn)橐宜狒且活惪焖俜磻?yīng)劑，在進(jìn)入到淀粉內(nèi)部前已經(jīng)和外部的羥基進(jìn)行了反應(yīng)。Chen Zhenghong等研究結(jié)果證實(shí)淀粉和乙酸酐發(fā)生反應(yīng)時(shí)，主要發(fā)生在淀粉的無定形區(qū)域及結(jié)晶區(qū)域的外層[6]。Stapley等也證明快速反應(yīng)試劑會(huì)在較大程度上和淀粉顆粒外層的羥基發(fā)生反應(yīng)[30]。

圖4 表面糊化處理前后小麥改性淀粉取代度Fig. 4 Substitution degree of the wheat starches before and after surface gelatinization

3 結(jié) 論

小麥原淀粉主要由支鏈與直鏈淀粉組成，前者峰形較為尖銳，說明其相對(duì)分子質(zhì)量較為集中；后者峰寬高但強(qiáng)度低，表明其是由一些不同聚合度的直鏈淀粉分子組成，聚合度呈連續(xù)分布。通過凝膠排阻色譜發(fā)現(xiàn)，表面糊化后剩余淀粉的藍(lán)值及總糖含量明顯下降，表明小麥淀粉經(jīng)表面糊化處理后部分被移除或降解。通過測(cè)定其剩余淀粉顆粒中直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)可知，隨著表面糊化處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨之降低；且剩余小麥A淀粉的直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)要高于剩余小麥B淀粉的含量，證明隨著顆粒大小的增加其直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。通過淀粉表面糊化處理前后的取代度測(cè)定結(jié)果可知，單一及復(fù)合改性的取代反應(yīng)都主要發(fā)生在淀粉顆粒的表層，顆粒內(nèi)部發(fā)生取代反應(yīng)的概率較小。