長黑青稞中不同形態多酚的提取及體外抗氧化活性

朱昱琳，楊士花，黃勇樺，李永強,*，張建平，李 晴，陳 壁，初雅潔，李 淳，黃艾祥

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學外語學院，云南 昆明 650201；3.云南昆明國家糧食儲備中轉庫，云南 昆明 650201；4.大理農林職業技術學院，云南 大理 671003；5.永平縣綜合檢驗檢測院，云南 永平 672660）

多酚是一類廣泛存在于植物中的次生代謝產物，能抑制脂質和其他生物分子過氧化[1]，具有清除自由基、抗炎、抑菌、延緩衰老和增強機體免疫力等作用[2-4]，能夠預防心血管疾病[5]、糖尿病[6]和癌癥[7]等。多酚按結構分為黃酮、酚酸、芪類和木脂素等[8]，根據溶解性可分為可溶性和不可溶鍵合多酚[9]?？扇苄远喾涌衫盟芤夯蛩c甲醇、丙酮等有機溶劑混合進行提取[10]。不可溶鍵合多酚主要以酯鍵和醚鍵等形式與碳水化合物、蛋白質等生物大分子物質結合[9,11]，無法利用溶劑直接提取，一般采用酸解、堿解或酶解后再進行提取[12]。

由于膳食多酚具有促進健康的潛在功能，其提取和生物活性成為近年來的研究熱點。研究發現，大麥[3]、水果[13-15]、堅果[16]、加工廢棄物[17-18]中可溶性多酚的含量高于不可溶鍵合多酚，并且可溶性多酚具有更 高的抗氧化活性。研究者從茶籽[19]、水果[20-21]、谷物[10,22-24]中提取了游離、酯化和不可溶鍵合多酚，其中不可溶鍵合多酚的含量及其抗氧化活性最高。陸洋等[25]從老黑谷米面粉中提取分離了可溶性、游離、酯化、醚化和鍵合多酚，發現可溶性多酚的含量和體外抗氧化能力最高。蜂蜜[2]、大麥[3]和水果[14]中可溶性多酚具有顯著的抗炎和抗增殖能力。同時，研究發現谷物中的多酚主要是酚酸和黃酮，其中酚酸包括羥基苯甲酸和羥基肉桂酸，并且阿魏酸是主要的酚類化合物[10,24,26]。

青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook.f.）是一種成熟后外稃與穎果分離且籽粒裸露的大麥[27]，是云南省迪慶藏族自治州的特色農作物，其在極寒、低溫和強紫外線輻射的逆境下積累了大量的多酚化合物[28-29]。目前國內外對總可溶性多酚的研究較多，忽略了不可溶鍵合多酚，因此不能準確反映多酚的真實含量和生物活性。張一鳴等[29]對云黑青稞中的可溶性多酚進行了提取和純化工藝的研究。但對于長黑青稞中不同形態多酚的提取、含量測定及其生物活性研究鮮見報道。本實驗在前期研究的基礎上對長黑青稞中總可溶性、游離、醚化、酯化和不可溶鍵合多酚進行提取，測定5 種多酚的多酚含量、黃酮含量和體外抗氧化活性，并分析5 種形態多酚的化合物組成，為客觀評價長黑青稞中多酚含量和抗氧化活性提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長黑青稞樣品購自云南省迪慶藏族自治州農業科學研究所。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、Folin-Ciocalt eu試劑、Trolox美國Sigma公司；三 吡啶基三嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine，TPTZ）、2,2-聯氨雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2-azinobis(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonate，ABTS）、三氯乙酸、三氯化鐵、過氧化氫、硫酸亞鐵、抗壞血酸 上海晶純生化科技股份有限公司；沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、對羥基苯甲酸、表兒茶素、咖啡酸、香草酸、丁香酸、香草醛、(－)-表沒食子兒茶素、對香豆酸、阿魏酸、楊梅素、槲皮素、反式肉桂酸、山柰酚、芹菜素 北京北納創聯生物技術研究院；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MF-304型不銹鋼五谷雜糧磨粉機 廣州雷邁機械設備有限公司；A360型紫外-可見分光光度計 翱藝儀器（上海）有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；TDL-5-A型離心機 上海安亭科學儀器廠；PHS-3E數字型pH計 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚化合物的提取

參考Chandrasekara[10]、陸洋[25]、鄒青飛[30]等的方法并稍作修改。將脫脂后的長黑青稞樣品用體積分數70%丙酮溶液提取，離心得上清液和殘渣，上清液即為總可溶性多酚，殘渣用來提取不可溶鍵合多酚。總可溶性多酚用12 mol/L HCl溶液調節pH值至2，與乙醚等體積混合萃取5 次，有機相即為游離多酚；提取游離多酚后的水相用2 mol/L NaOH溶液室溫下水解4 h，用HCl溶液調節pH值為2，室溫下4 000×g離心10 min，用乙醚和乙酸乙 酯等體積混合，萃取5 次，有機相即為酯化多酚；提取酯化多酚后的水相加入20 mL 1 mol/L HCl溶液，95 ℃水浴中加熱45 min，室溫下冷卻，用乙醚等體積混合，提取5 次，有機相即為醚化多酚。提取總可溶性多酚后的殘渣用4 mol/L NaOH溶液水解，用6 mol/L HCl溶液調節pH值至2，室溫下4 000×g離心30 min，上清液用乙醚和乙酸乙酯等體積混合，萃取5 次，有機相即為不可溶鍵合多酚。所有多酚提取物均充氮氣于0～4 ℃下避光保存備用。

1.3.2 多酚化合物含量測定

1.3.2.1 多酚含量測定

多酚含量測定采用Li Qing[9]、鄒青飛[30]、Guo Weiwei[31]等改進的Folin-Ciocalteu法。以阿魏酸為標準品制定標準曲線：y＝1.289x－0.003（R2＝0.998），根據標準曲線計算多酚含量，所得結果用每克長黑青稞干樣品中阿魏酸物質的量表示，單位為μmol/g。

1.3.2.2 黃酮含量測定

黃酮含量測定采用改進的AlCl3比色法[32]。以兒茶素為標準品制定標準曲線方程：y＝2.545 9x－0.011 4（R2＝0.999），根據標準曲線計算黃酮含量，所得結果用每克長黑青稞干樣品中兒茶素物質的量表示，單位為μmol/g。

1.3.3 體外抗氧化活性測定

1.3.3.1 鐵離子還原/抗氧化能力測定

鐵離子還原/抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）的測定參考Li Qing[9]和Benzie[33]等的方法并稍作修改。取適量的樣品溶液與3 mL FRAP溶液充分混合，于37 ℃下放置4 min，在593 nm波長處測定其吸光度。以甲醇作為空白。用FeSO4制定標準曲線，標準曲線方程為：y＝6.24x+0.000 5（R2＝0.998）。式中：y為吸光度；x為硫酸亞鐵濃度/（mmol/L）。FRAP以每克長黑青稞干樣品中Fe2+的物質的量表示，單位為mmol/g。

1.3.3.2 過氧化氫清除能力測定

過氧化氫清除能力（hydrogen peroxide scavenging activity，HPSA）測定參考黃佳琦等[34]的方法。吸取適量樣品溶液，加入2.4 mL磷酸鹽緩沖液（45 mmol/L、pH 7.4）和0.9 mL過氧化氫溶液（40 mmol/L）；30 ℃水浴反應40 min，在230 nm波長處測定其吸光度。以甲醇作為空白。用阿魏酸制定標準曲線，標準曲線方程為：y＝47.338x+32.772（R2＝0.998）。式中：y為過氧化氫清除率/%；x為阿魏酸濃度/（μmol/L）。過氧化氫清除率按式（1）計算。HPSA以每克長黑青稞干樣品中阿魏酸的物質的量表示，單位為μmol/g。

式中：A0為空白溶液的吸光度；A1為樣品的H2O2溶液的吸光度。

1.3.3.3 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力（DPPH radical scavenging activity，DRSA）測定參考Li Qing[9]和Hatano[35]等的方法。吸取適量樣品溶液，加2 mL DPPH-甲醇溶液，混勻，室溫下暗處放置10 min，在517 nm波長處測定其吸光度。以甲醇作為空白溶液。用阿魏酸制定標準曲線，標準曲線方程為：y＝451.75x+32.31（R2＝0.998）。式中：y為DPPH自由基清除率/%；x為阿魏酸濃度/（μmol/L）。DPPH自由基清除率按式（2）計算。DRSA以每克長黑青稞干樣品中阿魏酸的物質的量表示，單位為μmol/g。

式中：A0為空白溶液的吸光度；A1為樣品的DPPH-甲醇溶液的吸光度。

1.3.3.4 總抗氧化能力測定

總抗氧化能力（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）測定參考Re等[36]的方法并稍作修改。吸取適量樣品溶液，加入3.8 mL提前配制的ABTS溶液，室溫下反應6 min后，在734 nm波長處測定其吸光度。以甲醇作為空白溶液。用Trolox制定標準曲線，標準曲線方程為：y＝103.95x+1.566 3（R2＝0.998）。式中：y為ABTS陽離子自由基清除率/%；x為Trolox濃度/（mmol/L）。ABTS陽離子自由基清除率按式（3）計算。TEAC以每克長黑青稞干樣品中Trolox的物質的量表示，單位為μmol/g。

式中：A0為空白溶液的吸光度；A1為樣品中加入ABTS溶液的吸光度。

1.3.4 青稞多酚化合物高效液相色譜分析

參照Li Qing[9]、鄒青飛[30]等的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）方法對青稞總可溶性、游離、酯化、醚化和不可溶鍵合多酚提取物中酚類化合物進行組成分析。HPLC條件為色譜柱：Zorbax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 mL/min；進樣量：1 μL；柱溫：30 ℃；檢測器：G1315B23二極管陣列檢測器；檢測波長280 nm，梯度洗脫程序：0 min，5%（體積分數，下同）甲醇（體積分數0.5%甲酸-水溶液配制，下同）；20 min，95%甲醇；21 min，5%甲醇；25 min，5%甲醇。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 長黑青稞中多酚化合物含量

圖1 長黑青稞中總可溶性、游離、酯化、醚化和不可溶鍵合多酚提取物中多酚和黃酮含量Fig. 1 Contents of polyphenols and fl avonoids in total soluble, free,esterified, etherified, and insoluble-bound phenolic fractions from‘Changhei’ hulless barley

由圖1A可見，長黑青稞中總可溶性多酚含量最高，為（16.97±0.25）μmol/g，同時不可溶鍵合多酚含量顯著高于游離、酯化和醚化多酚（P＜0.05）。Zhu Yong[3]、陸洋[25]、Chandrasekara[37]等研究發現谷物中總可溶性多酚含量高于不可溶鍵合多酚。Kim[20]研究發現漿果中不可溶鍵合多酚含量顯著高于游離和酯化多酚，這與本研究結果相一致。說明青稞中總可溶性多酚占較大比例，多酚化合物能夠與膳食纖維通過共價鍵和非共價鍵結合形成不可溶鍵合多酚。由圖1B可見，5 種多酚提取物中黃酮含量變化和多酚類似，總可溶性黃酮含量最高，為（1.08±0.11）μmol/g，顯著高于其他4 種黃酮。Chandrasekara等[37]報道過類似的實驗結果，發現小米中可溶性黃酮含量高于不可溶鍵合黃酮。

2.2 長黑青稞多酚的體外抗氧化活性

圖2 長黑青稞中5 種多酚提取物的抗氧化活性Fig. 2 Antioxidant activities of 5 phenolic fractions from ‘Changhei’hulless barley

如圖2所示，長黑青稞中5 種多酚的FRAP、DRSA和TEAC變化趨勢和多酚含量類似，總可溶性多酚最高，不可溶鍵合多酚其次，二者都顯著高于游離、酯化和醚化多酚（P＜0.05）。在HPSA中，不可溶鍵合多酚最高，游離、酯化和醚化多酚顯著低于總可溶性多酚（P＜0.05）。研究發現，谷物[9,37]、水果[13]、堅果[16,18]中可溶性多酚的FRAP、DRSA、TEAC高于不可溶鍵合多酚。Chandrasekara等[37]研究發現小米中不可溶鍵合多酚的HPSA比可溶性多酚高，這與本研究結果一致。說明多酚體外抗氧化活性的差異可能與多酚含量及其酚類化合物組成和結構特征有關。

2.3 多酚含量與抗氧化能力間的相關性

表1 長黑青稞中5 種多酚的多酚含量與抗氧化能力的相關性Table 1 Correlation between phenolic contents and antioxidant capacities of 5 phenolic fractions from‘Changhheeii’ hulless b arrlleeyy

由表1可知，長黑青稞的多酚含量與4 種抗氧化能力之間均存在顯著正相關，且FRAP與DRSA和多酚含量間呈現極顯著正相關（R2＝0.966和0.998），說明長黑青稞的抗氧化能力與多酚含量有關，而且可能與多酚化合物種類和結構存在一定關系[38-39]。

2.4 長黑青稞酚類化合物的組成分析結果

本實驗對長黑青稞中5 種多酚的18 種酚類化合物組成進行了HPLC分析，通過對比18 種標準品的保留時間和峰面積，確定長黑青稞中5 種多酚的酚類化合物組成和含量（圖3）。

圖3 酚類化合物標準品HPLC圖Fig. 3 HPLC chromatograms of mixture of phenolic compounds standards

從表2中可知，長黑青稞多酚中含有18 種酚類化合物，包括羥基苯甲酸、羥基肉桂酸和類黃酮3 類。在羥基苯甲酸中，總可溶性多酚中香草酸含量最高；不可溶鍵合多酚中香草醛含量最高；游離、酯化和醚化多酚中原兒茶酸含量最高。在羥基肉桂酸中，總可溶性多酚中咖啡酸含量最高；游離、酯化、醚化和不可溶鍵合多酚中阿魏酸含量最高；不可溶鍵合多酚中阿魏酸含量顯著高于其他4 種多酚，Zhu Yong[3]和Adom[40]等發現，谷物中有98%阿魏酸都是以結合態形式存在，并且阿魏酸是谷物中最豐富的酚類化合物。在類黃酮中，總可溶性、游離、酯化和醚化多酚中兒茶素含量最高，不可溶鍵合多酚中楊梅素含量最高。

表2 長黑青稞中5 種多酚提取物的酚類化合物含量Table 2 Contents of phenolic compounds in 5 phenolic fractions from‘Changghheeii’ hulless barley

3 結 論

從長黑青稞中提取總可溶性、游離、酯化、醚化和不可溶鍵合5 種形態多酚，分別測定了多酚含量、黃酮含量、酚類化合物組成和體外抗氧化活性，發現長黑青稞中總可溶性多酚和黃酮含量最高，分別為（16.97±0.25）μmol/g和（1.08±0.11）μmol/g；總可溶性多酚的FRAP、DRSA和TEAC均高于其他4 種多酚，不可溶鍵合多酚的4 種抗氧化能力均顯著高于游離、酯化和醚化多酚；多酚的體外抗氧化能力與含量呈顯著正相關（R2＝0.880～0.998）；同時，通過對多酚的組成分析可知，長黑青稞中酚類化合物包括羥基苯甲酸、羥基肉桂酸和類黃酮3 類，含有18 種酚類化合物，其中原兒茶酸、阿魏酸和兒茶素含量較高。綜上，長黑青稞多酚具有較好的抗氧化活性。本實驗可為長黑青稞的開發利用提供科學依據。