清毒栓提取物通過調節Foxp3影響β-catenin通路從而抑制SiHa細胞活性的研究*

耿韋華 ，樓姣英 ，張 靜，王 瑩 ，李 美

（1．北京中醫藥大學，北京 100029；2．北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078）

宮頸癌的發病率和病死率均居全球女性惡性腫瘤第4位[1]，嚴重威脅女性身體健康和生命安全。人乳頭瘤病毒（HPV）持續感染是目前國內外公認的宮頸癌致病因素之一[2]，機體免疫力尤其是宮頸局部免疫微環境對于HPV感染的清除至關重要。調節性T細胞（Treg）是一類具有獨特免疫調節功能的T細胞亞群，具有免疫抑制性和免疫無能性，參與宮頸癌等惡性腫瘤的發生發展，促進腫瘤的免疫逃逸[3]。Foxp3是天然Treg最可靠的標記物，是Treg發揮作用的決定因素[4]。有研究表明[5]，Treg細胞高表達Foxp3可以顯著抑制機體的免疫反應。本課題組前期研究結果顯示，清毒栓可以抑制宮頸癌SiHa細胞活性[6]，通過促進相關免疫因子的表達來提高機體抗腫瘤能力[7]，但是否與Foxp3有關，具體通過何種途徑激活相關基因的表達，需要深入研究至分子信號通路方面。本研究以宮頸癌SiHa細胞為研究對象，探討清毒栓提取物通過Foxp3調控β-連環蛋白（β-catenin）信號通路抑制宮頸癌SiHa細胞活性的機制，以期為臨床靶向治療宮頸癌提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 細胞株 人宮頸癌SiHa細胞，購自中國醫學科學院基礎醫學研究所。

1.2 實驗用藥 清毒栓主要組成為紫草、莪術、黃柏等，均購自北京同仁堂藥店，將復方藥物分別醇提（紫草）、油提（莪術）、水煎（黃柏），去渣濃縮后1劑藥濃縮至20 mL，終濃度約為4．2 g/mL，高溫消毒后于4℃冰箱密封保存。

1.3 實驗動物 C57BL/6小鼠22只，日齡49 d，購自三峽大學實驗動物中心，許可證號：SCXX（鄂），2017-0012。分籠飼養，溫度24～26℃，相對濕度50%～60%，通風良好，每日光照12 h，晝夜交替。

1.4 主要試劑 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、胎牛血清（FBS）、DMEM 培養基（Gibco公司）；pGEM-Foxp3重組質粒（北京義翹神州科技有限公司）；脂質體2000（LipofectamineTM2000，Thermo Fisher公司）；苯甲基磺酰氟（PMSF，南京沃宏公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Bio-Rad公司）；裂解液（碧云天公司）；Foxp3 抗體、G1/S-特異性周期蛋白-D1（cyclin D1）抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3） 抗體、c-Myc抗體、β-連環蛋白抗體（β-catenin antibody，1∶1 000，Affinity公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（1∶2 500，Abcam 公司）；辣根過氧化物酶（HRP）二抗（1∶4 000；Dianova，Hamburg，Germany公司）；ECL顯影液（Bio-Rad公司）；CCK8檢測試劑盒（七海生物公司）等。

1.5 主要儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京市長風儀器儀表公司）；PCR擴增儀（北京東勝創新生物科技有限公司）；水平電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；MultiskanMK3酶標儀（MD公司）等。

2 方法

2.1 血清制備與提取 將22只C57BL/6小鼠隨機分為空白組和藥物組，每組各11只；分別用PBS和中藥對兩組小鼠進行灌胃，早晚各1次，每次灌胃量為0．4 mL，連續灌胃3 d；兩組小鼠均于最后1次給藥后1～2 h摘眼球取血；將血液靜置30 min后，3 000 r/min，離心半徑14 cm，離心10 min，取上清分裝到1 mL無菌EP管中，保存至-80℃冰箱備用。用前56℃水浴30 min，滅活補體。

2.2 細胞培養和轉染 SiHa細胞使用含有10%FBS的DMEM培養基在37℃，5%CO2條件下進行培養。以pGEM-Foxp3為模板擴聚合酶鏈式反應（PCR）得到目的片段后切膠回收，將目的片段連接pcDNA3．1載體，質粒DNA轉化DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆后，提取質粒，利用LipofectamineTM2000進行質粒轉染，建立穩定轉染高表達Foxp3的HPV感染陽性SiHa細胞，同時利用 pcDNA3．1空載體轉染SiHa細胞株，作為本研究對照組，具體克隆及轉染操作嚴格按照試劑盒使用說明進行。

2.3 SiHa細胞培養分組 空白對照組：空白質粒中加入空白血清，即0%含藥血清進行培養；Foxp3過表達組：Foxp3過表達質粒中加入空白血清進行培養；空染血清組：空白質粒中加入濃度為15%含藥血清進行培養；Foxp3過表達血清組：Foxp3過表達質粒中加入濃度為15%含藥血清進行培養。每組各3例。

2.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測Foxp3蛋白表達水平 分別用空白血清和15%含藥血清對Foxp3過表達質粒組及空白質粒組進行血清培養72 h，之后檢測4組SiHa細胞中Foxp3蛋白的相對表達量，具體步驟如下：1）蛋白提取及濃度測定：細胞用含有PMSF的裂解液裂解后測定濃度，將10 μg從細胞中獲得的細胞裂解液與5×樣品緩沖液混合后，將樣品上樣至10%的聚丙烯酰胺凝膠中。2）轉膜：SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離并轉移至PVDF膜上。3）封閉：用含 0．1%聚山梨酯（Tween）的 4%牛奶進行封閉。4）加入Fxop3antibody和GAPDHantibody抗體，4℃孵育過夜。5）洗膜：用含 0．1%Tween的PBS溶液將膜洗3遍。6）加入二抗：加入含0．1%Tween的4%牛奶以及HRP二抗在室溫條件下孵育1 h。7）顯影：在膜上滴加ECL顯影液并放入GelDoc成像系統（Bio-Rad）進行拍照。8）進行圖像采集，計算目標蛋白與內參GAPDH灰度值的比值。

2.5 CCK8法檢測SiHa細胞活性 細胞按照要求轉染處理后，取對數生長期SiHa細胞，經胰酶消化、離心、細胞計數后，調整細胞懸液密度為1×105個/mL，接種于規格為96孔的培養板內（150 μL/孔）；然后將培養板置入培養箱內，待細胞貼壁變形后，在兩組Foxp3過表達質粒組及兩組空白質粒組中以150 μL/孔分別加入含藥血清和空白血清，各組設5復孔。而后將培養板置入5%的CO2培養箱中孵育，于72 h后加入10 μL CCK8試劑，混勻，采用酶標儀測定各孔450 nm處的吸光度（A）值。

2.6 Western Blot法檢測Foxp3下游信號分子的表達 經血清培養后，用WesternBlot法對4組細胞Foxp3下游信號分子 β-catenin、c-Myc、cyclinD1、Caspase-3的蛋白水平進行檢測，具體檢測方法同上。

2.7 數據處理 檢測結果應用SPSS 21．0軟件分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 Western Blot法檢測不同組別SiHa細胞中Foxp3蛋白水平 Foxp3過表達組與空白對照組相比、Foxp3過表達血清組與空染血清組相比，SiHa細胞中Foxp3的相對表達量均增加，差異均具有統計學意義（P＜0．01）；空染血清組與空白對照組相比、Foxp3過表達血清組與Foxp3過表達組相比，Foxp3的相對表達量均下降，差異均具有統計學意義（P＜0．01）；Foxp3過表達血清組與空白對照組相比，Foxp3 相對表達量無統計學差異（P＞0．05）。見圖 1。

圖1 Western Blot法檢測SiHa細胞Foxp3蛋白水平的條帶圖及灰度統計圖（±s，n=3）Fig.1 Histogramandgrayscalestatisticalmapofthelevelof Foxp3 in SiHa cells detected by Western Blot（±s，n=3）

3.2 CCK8法檢測SiHa細胞活性 結果顯示，Foxp3過表達組與空白對照組相比、Foxp3過表達血清組與空染血清組相比，Foxp3過表達質粒組的A 值均增加，差異均具有統計學意義（P＜0．01）；空染血清組與空白對照組相比、Foxp3過表達血清組與Foxp3過表達組相比，含藥血清組的A值較相應的對照組均下降，差異均具有統計學意義（P＜0．01）；Foxp3過表達血清組與空白對照組相比，A值無統計學差異（P＞0．05）。見圖 2。

圖 2 CCK8 法檢測細胞活性（±s，n=3）Fig.2 Cell activity detected by CCK8（±s，n=3）

3.3 Western Blot法檢測Foxp3下游信號分子的表達 Foxp3過表達組與空白對照組相比、Foxp3過表達血清組與空染血清組相比，β-catenin、c-Myc、cyclinD1 的蛋白表達量均增加（P＜0．01）而 Caspase-3的蛋白表達量均降低（P＜0．05 或 P＜0．01）；空染血清組與空白對照組相比、Foxp3過表達血清組與Foxp3 過表達組相比，β-catenin、c-Myc、cyclinD1相對表達量均下降而Caspase-3的蛋白表達量均增高（P＜0．01）。見圖 3。

圖3 Western Blot法檢測Foxp3下游信號分子的表達（±s，n=3）Fig.3 Expression of Foxp3 downstream signal molecule detected by Western Blot（±s，n=3）

4 討論

Foxp3是調控Treg細胞發育功能的關鍵轉錄分子[8-9]。有研究證實[10-11]，Foxp3突變可能導致免疫反應受損，并促進自身免疫疾病發展，減弱對某些腫瘤和感染的免疫。Huang等[12]發現Foxp3在宮頸癌腫瘤細胞中的表達水平較高，約為91．56%，且Foxp3表達水平與腫瘤大小及FIGO分期明顯相關，因此Foxp3可能是預測宮頸癌患者治療效果的有用生物標志物。

經典Wnt/β-catenin信號通路的異常激活會導致β-catenin不被降解，在核內堆積，促進下游靶基因，如c-Myc和cyclinD1等的轉錄，引起細胞增殖/分化失控，使細胞過度增殖惡化[13-14]。c-Myc和cyclinD1作為重要的細胞周期調控蛋白，在細胞增殖、細胞周期規則表達中發揮重要作用。Caspase-3則是經典凋亡中的一種重要蛋白，由內源性（線粒體）和外源性（死亡配體）凋亡通路激活，參與經典的卵裂后凋亡通路，他們均與惡性腫瘤的抑制密切相關[15-16]。

金哲教授以“攻毒散結”為法，研制出中藥清毒栓，在治療HPV感染引起的宮頸癌及宮頸上皮內瘤變等方面取得了較為滿意的臨床效果[17]。前期課題研究發現清毒栓可能是通過阻斷細胞從G0～G1期向S期分化及促進其凋亡而達到抑制腫瘤的作用[6]，也可能抑制Treg對細胞毒T淋巴細胞（CTL）中相關蛋白的上調來改變局部免疫微環境而達到抑制腫瘤的作用[18]。Foxp3作為Treg重要的轉錄因子，對維持其功能起重要作用，清毒栓的抗腫瘤作用機制是否與其有關，有待研究。Ghasemi等[19]研究證實，Wnt/β-catenin信號通路異常表達與宮頸癌的發生、發展密切相關，清毒栓是否通過該通路起作用，也有待證實。實驗檢測了不同組別SiHa細胞中Foxp3蛋白水平及其細胞活性，并對Foxp3下游信號分子進行檢測，目的是研究Foxp3在SiHa細胞中的影響以及在清毒栓誘導的SiHa活性下調中的角色，進一步闡明清毒栓的作用機制與Treg細胞及Foxp3的關系，從而為中藥預防HPV相關宮頸癌的發生提供更加充足的理論依據。

實驗采用Western Blot法檢測分別經空白血清及15%含藥血清處理的過表達質粒組及空載質粒組的Foxp3及其下游信號分子β-catenin、c-Myc、cyclinD1、Caspase-3的表達，并用CCK8法檢測4組細胞的活性。過表達質粒組與相應的空白質粒組相比，Foxp3的表達量均增高，SiHa細胞的活性均增高，說明已成功建立穩定的Foxp3過表達SiHa細胞株，且Foxp3過表達可促進宮頸癌SiHa細胞的增殖。含藥血清處理的組別較相應的對照組Foxp3的表達量和SiHa細胞的活性均降低，說明清毒栓含藥血清可抑制SiHa細胞中Foxp3的表達并可抑制SiHa細胞活性。15%含藥血清處理的Foxp3過表達質粒組與空白血清處理的空白質粒組兩組比較無統計學意義，表明通過過表達可逆轉含藥血清導致的Foxp3表達下調，可改變含藥血清的藥效，從而說明含藥血清通過Foxp3起到調節作用。對Foxp3下游信號分子的檢測發現，Foxp3可以顯著增加βcatenin、c-Myc、cyclinD1 含量并抑制 Caspase-3 剪切，且可以抑制含藥血清誘導的β-catenin、c-Myc、cyclinD1含量下調以及Caspase-3剪切增加，說明清毒栓含藥血清是通過調節Foxp3影響β-catenin通路而發揮調節作用的。

綜上所述，Foxp3可通過激活β-catenin通路促進細胞增殖和抑制細胞凋亡來增加SiHa細胞活性，在SiHa細胞中扮演著原癌基因角色，而清毒栓含藥血清可能通過調節Foxp3影響β-catenin通路從而抑制SiHa細胞活性。本研究結果進一步闡明了清毒栓提取物通過調節Foxp3抑制SiHa細胞活性的機制，為日后研發有效的抗腫瘤中藥提供一定的思路及理論依據，但β-catenin、cyclinD1和c-Myc不能完全解釋細胞周期調控的精確機制，進一步研究細胞周期調控的機制可能會給宮頸癌的治療帶來突破性進展。