雙孢蘑菇二次發酵料高溫菌的提取與鑒定

雋加香 王倩 陳輝 張津京 宋曉霞 肖婷婷 陳明杰 黃建春

摘要? ? 本試驗采集了雙孢蘑菇工廠制備的二次發酵料，通過配制不同類型的選擇培養基，采用涂布分離的方法，于溫度為55 ℃、濕度為60%～70%的恒溫培養箱中培養，從二次發酵料浸出液中得到高溫菌單菌落，再進行純化，然后提取純化后的高溫菌基因組DNA，采用NCBI物種相似度比對進行鑒定。結果表明，在馬丁氏培養基上得到棕黑腐質霉（Humicola fuscoatra）和短柄帚霉（Scopulariopsis brevicaulis），相似度對比均達到99.4%以上。

關鍵詞? ? 雙孢蘑菇;二次發酵料;高溫菌

中圖分類號? ? S646.11? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）06-0076-01? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

隨著人們生活水平的提高，市場對于食用菌的需求越來越大，生產食用菌需要制備大量培養料，制備良好的培養料中含有大量的有益微生物，其中有些重要微生物必須在培養料的發酵過程中才能正常生長，有些重要微生物可以在分離純化后人工培養。雙孢蘑菇（Agaricus bisporus（J.E.Lange）Imbach.）又稱白蘑菇，是世界栽培面積最廣的食用菌，占全球食用菌產量的38%。雙孢蘑菇培養料腐熟過程中各類高溫菌大量繁殖，如嗜熱性細菌、嗜熱性放線菌、嗜熱性霉菌，參與一次發酵與二次發酵中的各種生理生化過程，與有害微生物存在競爭關系，對發酵料的pH值、EC值、碳氮比、營養物質含量等有密切的影響，最終影響到培養料的質量與雙孢蘑菇的產量。倘若能從培養料中分離提取并鑒定出小部分起重要作用的嗜熱性微生物，可以加深對發酵料腐熟的機理與過程的認識，可以為培養料制備過程提供指導，也有利于培養料微生物添加劑的開發。一般此類嗜熱性微生物最適宜的溫度范圍為45～55 ℃，最高溫度范圍為60～90 ℃，最低溫度范圍為25～45 ℃，而嗜溫性微生物與嗜冷性微生物的最高溫度范圍分別為30 ℃和43 ℃。本試驗以55℃作為篩選培養的溫度，能夠保證篩選分離出的微生物均為嗜熱性微生物。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

從上海聯中食用菌的雙孢蘑菇二次發酵料料倉中部采集出的表面有明顯白色放線菌的出倉二次料，用無菌自封袋封裝。

馬丁氏培養基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂20.0 g，孟加拉紅0.033 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 000 mL;121 ℃，30 min滅菌;用于分離培養絲狀真菌。

1.2? ? 高溫菌提取與純化

1.2.1? ? 出倉二次發酵料的活化。將用無菌自封袋封裝的二次發酵料置于55 ℃、濕度約為60%的恒溫培養箱中活化12 h。

1.2.2? ? 篩選分離與純化。取5～10 g二次發酵料浸沒于無菌水中，振蕩10 min，吸取一定量的二次料浸出液，將浸出液稀釋出10倍、100倍、1 000倍、10 000倍、100 000倍、1 000 000倍6個濃度梯度，將6個濃度的菌液分別涂布于上述各類培養基上。

將已涂布有菌液的各類培養基倒置于55 ℃、濕度為60%～70%的培養箱中，恒溫培養12 h，即可肉眼看見不同的單菌落;待圓形菌落半徑擴大至1 cm左右時，用接種針挑取各菌落外圍的微生物接種至同類培養基中進行純化培養，純化操作的次數取決于純化程度。

將雙孢蘑菇二次料浸出液稀釋后直接涂布在馬丁氏培養基上，篩選出重要微生物的概率較小，因而使用這種培養基時，在方法上要做一定改良。改良方法如下：用鑷子夾取2 cm左右的二次料秸稈接種在培養基上，倒置于55 ℃、濕度約為70%的培養箱中，恒溫培養1 d，即可發現有菌類在培養基上生長，菌落半徑擴大至1 cm左右時，用接種針挑取菌落外圍的微生物接種至同類培養基中進行純化培養。

1.3? ? 鑒定

參照上海桑尼生物科技有限公司物種鑒定方法[1]。

2? ? 結果與分析

2.1? ? 純化菌種在不同培養基上的生長情況

涂布有菌液的馬丁氏培養基倒置于55 ℃、濕度60%恒溫培養箱中，12 h后肉眼可看見生長的菌落，并繼續進行純化培養。觀察發現，該菌落生長緩慢，60 h左右可完成純化過程，長出白色毛狀和深色圓形菌落。浸出液稀釋濃度梯度對比發現，稀釋10倍的浸出液可優先得到菌落（圖1）。

2.2? ? 純化菌種的鑒定

將馬丁氏培養基上生長純化后的菌落提取高溫菌基因組DNA，采用NCBI物種相似度比對進行鑒定。得到短柄帚霉（Scopulariopsis brevicaulis）、棕黑腐質霉（Humicola fuscoatra），相似度對比分別為99.49%、99.46%。

3? ? 結論與討論

雙孢蘑菇二次培養料主要由木質纖維素成分和嗜熱微生物組成，微生物菌群和雙孢蘑菇菌絲體共同降解利用培養料中木質纖維素成分，對蘑菇產量和品質起到了關鍵性作用[2-3]。對嗜熱微生物菌落的種類和特征進行研究有助于制作出培養料微生物菌劑或生物表面活性劑，從而改善微生物群落，提高堆肥培養料中纖維素的分解程度，有利于菌絲更好地吸收和利用，達到刺激蘑菇生長或增產的效果，進一步提高雙孢蘑菇工廠化周年生產的效益。

本研究從馬丁氏培養基平板上得到了嗜熱真菌短柄帚霉（Scopulariopsis brevicaulis）和棕黑腐質霉（Humicola fusc-oatra）單菌落，相似度對比均達99.4%以上。首先，嗜熱真菌產生的嗜熱酶具有很強的纖維素降解能力，能降解細菌菌體;其次，嗜熱真菌在繁殖過程中分泌次級代謝產物，如腐質霉菌會分泌V■，可作為蘑菇菌絲的營養素來源[4]。Wiegant[5]發現，嗜熱真菌可以刺激蘑菇菌絲萌發與生長，促進菌絲吃料，從而減少其他雜菌污染，相應地提高了蘑菇產量。

如上所述，嗜熱真菌的存在對雙孢蘑菇二次培養料發酵的好壞起了決定性作用，可以將這些有益微生物提取出來作為菌劑或生物表面活性劑添加到培養料中來提高蘑菇品質和產量[6]。本研究除了提取出通常報道的嗜熱真菌棕黑腐質霉（Humicola fuscoatra）外，還發現了一些不熟悉的嗜熱微生物短柄帚霉（Scopulariopsis brevicaulis）等新成員，極大地拓寬了人們對雙孢蘑菇二次發酵堆肥這一復雜生境中微生物的認識，也啟發了人們要善于利用分子生物學技術來獲得一些尚未培養出的微生物類群。

4? ? 參考文獻

[1] SCHOCH C L，SEIFERT K A，HUHNDORF S.Nuclear ribosomal internal transcribed spacer（ITS）region as a universal DNA barcode marker for fungi[J].Proceedings of the National Academy of Science，2012，109（16）：6241.

[2] JURAK E，KABEL M A，GRUPPEN H.Carbohydrates composition of compost during composting and mycelium growth of Agaricus bisporus[J].Carbohydrate，2014，101：281-288.

[3] 高曉靜，張昊琳，佟佳興，等.不同配方雙孢蘑菇培養料的細菌群落結構和理化性狀[J].應用與環境生物學報，2017，23（3）：502-510.

[4] 杜愛玲，陳立國，楊新美.雙孢蘑菇培養料微生物研究概況[J].湖北農業科學，2000（2）：51-53.

[5] WIEGANT W M.Growth characteristics of the thermophilic fungus Scyta-lidium thermophilium in relation to production of mushroom compost[J].Appl Environ Microbiol，1992，58：1301-1307.

[6] 李云福，李正風，董高峰，等.雙孢蘑菇培養料發酵過程中細菌群落動態變化[J].菌物研究，2019（2）：94-102.