上海市售鱖漁藥殘留現狀的調查研究

吳紅巖，趙金良，郝月月，朱書琴，周云紅

(上海海洋大學，農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306)

近些年，因漁藥違規超標使用引發的食品安全問題，已經引起了人們的廣泛關注。2006-2018年，全國共發生水產品質量安全事件172起，其中包括2006年上海多寶魚(Scophthalmusmaximus)事件、2007年山東多寶魚事件、2013年青島甲醛泡小銀魚(Cephalophyllumloreum)等事件[1]。水產養殖中常見的漁用藥物可分為禁用漁藥、限量漁藥和未監管漁藥三類。2002年，孔雀石綠(malachite green,MG)和硝基呋喃類(nitrofurans,NFs)已被列入《食用動物禁用的獸藥及其化合物清單》，標明在水產品養殖中禁止添加以及在水產品等動物源性食品中不得檢出?？兹甘G是一種有毒的三苯甲烷類人工合成有機化合物，可做染料，也可用于水產養殖殺菌，很容易在魚類體內累積[2]。在養殖環境中，孔雀石綠極易轉化為無色孔雀石綠，并難以消解。在孔雀石綠濃度為1 mg/L的池塘水體中，即使經過360 d的養殖活動，仍能在池塘底泥中檢測到無色孔雀石綠的殘留[3]。硝基呋喃類藥物主要用于水環境消毒，或拌餌投喂以防治細菌性疾病，尤其對腸球菌屬等革蘭氏陽性菌引起的感染、皮膚和粘膜損傷后的細菌感染具有良好的治療效果[4]。硝基呋喃類藥物及其代謝物在魚體內的代謝消除規律受養殖種類、給藥量及給藥次數等的影響，如青石斑魚(Epinephelusawoara)連續7 d投喂100 mg/kg硝基呋喃類藥物飼料，在停藥后163 d后仍可檢測到代謝物的存在[5]；斑點叉尾鮰(IetalurusPunetaus)連續7 d，每天2次投喂10 mg/kg的餌料，其代謝物AOZ在各組織中的消除至少需要90 d[6]；用呋喃西林2 mg/L藥浴雜交鱧(斑鱧Channamaculata♀×烏鱧Channaargus♂)2 d，其代謝物產物SEM需要60 d才能低于0.25 μg/kg的檢測限[7]。喹諾酮類(4-quinolones,4-Qs)藥物，主要作為厭氧菌、革蘭氏陰性菌的抗菌藥。一般是溶解后全池潑灑，或是拌料投喂[8]。但喹諾酮類藥物屬抗生素，可能會促使部分水生細菌產生耐藥性[9]，耐藥菌和有喹諾酮類殘留的水產品都有可能對消費者健康產生不利影響[10]。為此，農業部公告第2292號規定，諾氟沙星為禁用藥物，GB31650-2019規定[11]，恩諾沙星、環丙沙星屬殘留限量藥物，二者檢出量相加不得超過0.1 mg/kg。亞甲基藍(methylene blue,MB)是染料的一種，淡水養殖中可用于防治水霉病、紅嘴病和小瓜蟲病等。已有研究表明，10 mg/L亞甲基藍藥浴日本鰻鱺(Anguillajaponica)0.5 h，64 d后仍能檢測到亞甲基藍及其代謝物[12]，且亞甲基藍對魚卵胚胎的發育有一定的毒性作用[13]。目前美國食品監督管理局(FDA)已禁止亞甲基藍用于食用魚的養殖，日本《肯定列表》也規定其在水產品中最高限量標準為10 μg/kg，但中國目前對亞甲基藍在動物源性食品中的限量還沒有相關規定[14]。

鱖(Sinipercachuatsi)是我國傳統名貴淡水經濟魚類。在養殖生產過程中，鱖很容易受到多種病原生物(原生動物、細菌、真菌和病毒)的侵襲，難以擺脫漁用藥物的依賴。由于用藥不當，漁藥殘留問題比較突出，如2013年福建省養殖鱖孔雀石綠75.8 %的檢出率[15]、2015年廣東省鱖孔雀石綠19.1 μg/kg的檢出量[16]、以及2017農業部全國抽檢鮮活水產品(鱖)孔雀石綠及其代謝物14.8 %的檢出率。因此，鱖被農業農村部列入《2017年農產品質量安全專項整治方案》，“三魚兩藥”專項整治對象之一。隨著專項整治工作的落實與推進，本實驗選取上海地區為監測點，通過對水產品市場中鱖的全年抽樣，檢測養殖中常見漁藥(MG,NFs,4-Qs,MB)的殘留情況，了解鱖養殖中的用藥現狀，以期為鱖水產品的質量安全管理工作提供參考和依據。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀(安捷倫1100型配紫外熒光檢測器，美國安捷倫公司)；N-1300D型旋轉蒸發儀(日本EYELA公司)；MDF-U53V型超低溫冰箱(日本Sanyo公司)；5417R型高速冷凍離心機(德國Sartorius公司)；YP202N型電子精密天平(上海精密科學儀器有限公司)；DL-360A型超聲提取儀(上海之信儀器有限公司)；DS高速勻漿機(佛山市翁開爾貿易有限公司)；Vortex-2漩渦震蕩儀(上海滬析實業有限公司)；HSE-12D固相萃取裝置(重慶中普科技有限公司)。

1.1.2 試劑

孔雀石綠(CAS:569-64-2)及無色孔雀石綠(CAS:129-73-7)標準品(中國藥品生物制品檢定所，純度>98%)；呋喃唑酮(furazolidone,CAS:67-45-8)、呋喃妥因(furadantin,CAS:67-20-9)、呋喃西林(nitrofurazone,CAS:59-87-0)、呋喃它酮(furaltadone,CAS:139-91-3)，對應代謝物：3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)、1-氨基-2-乙內酰(AHD)、氨基脲(SEM)、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)的標準品，(美國Sigma公司，純度≥99 %)；環丙沙星(ciprofloxacin,CAS:85721-33-1)、恩諾沙星(enrofloxacin,CAS:93106-60-6)、諾氟沙星(norfloxacin,CAS:70458-96-7)標準品(北京北納創聯生物技術研究院，純度≥99.5 %)；亞甲基藍標準品(美國Sigma公司，純度≥99.5 %)。

冰乙酸、無水硫酸鈉、乙酸乙酯、鄰氯苯甲醛、庚烷磺酸鈉、甲醇為色譜純，正己烷、乙酸銨、二甘醇、四丁基溴化銨、磷酸二氫鈉、對甲苯磺酸、鹽酸羥胺為分析純，以及中性氧化鋁(100-200目)、酸性氧化鋁(80-120目)、氫氧化鈉、超純水(≥18 MΩ·cm@25 ℃)、0.22 μm微孔濾膜、0.45 μm微孔濾膜，均購自生工生物工程(上海)有限公司；三氯乙酸為優級純，異辛烷、乙腈、二氯甲烷、檸檬酸為色譜純，以及硅膠C18鍵合材料(100～200目)、吸附性離子交換樹脂(100～200目)均購自國藥集團化學試劑有限公司；陽離子交換萃取柱(100 mg/3 mL)、酸性氧化鋁柱(1 g/3 mL)、中性氧化鋁柱(1 g/3 mL)購自武漢敬信科技有限公司；C18-CN凈化柱(200mg/3mL)購自武漢市偉琪博星生物科技有限公司。

1.2 樣本采集與前處理

1.2.1 樣品采集

從2018年4月-2019年3月，每月下旬到上海市某水產批發市場隨機購買500 g左右的鱖6尾，密封袋打包充氧，活體運回實驗室。去皮后取背部肌肉，并分割成小塊，用絞肉機低溫絞碎均質，分類封裝，置-80 ℃保存待測。

1.2.2 前處理及測定

孔雀石綠及無色孔雀石綠樣品的前處理及測定均參照GB/T 19857-2005高效液相色譜法[17]；硝基呋喃類藥物樣品的前處理及測定均參照GB/T 1007-2008高效液相色譜法[18]；喹諾酮類藥物樣品的前處理及測定均參照農業部783號公告[19]；亞甲基藍樣品的前處理及測定均參照SN/T 1974-2007高效液相色譜法[20]；

1.2.3 色譜條件

取適量標準品，配制標準溶液，并依濃度梯度分別檢測獲取保留時間和出峰面積，作定量用。具體檢測的色譜條件參數見表1。

表1 檢測藥物及其代謝產物的色譜條件Tab.1 Chromatographic conditions for detecting drugs and metabolites

注：MG/LMG表示孔雀石綠/隱色孔雀石綠，NFs表示硝基呋喃類，4-Qs表示喹諾酮類，MB表示亞甲基藍。

1.2.4 質量控制

處理前，清洗均質器等前處理設備，防止污染。在對72份鱖樣分別進行10種藥物檢測的同時，設空白對照。當出現異常結果時，需對該批次樣重新測定。

1.3 數據處理

數據處理均采用SPSS19.0軟件分析，統計結果均以平均值±標準差的形式表示。

2 結果

2.1 孔雀石綠與無色孔雀石綠

全年共計檢測72尾鱖，孔雀石綠、無色孔雀石綠均無檢出樣(表2)。檢測鱖為市場采集，又因孔雀石綠、無色孔雀石綠的代謝周期較長，說明市售鱖在運輸和暫養過程中沒有孔雀石綠添加，以及當齡鱖違規使用孔雀石綠的可能性也不大。

2.2 硝基呋喃類藥物

全年共抽檢鱖樣品72份，檢出率為50 %(36/72)(表2)。呋喃唑酮代謝物(AOZ)、呋喃它酮代謝物(AMOZ)未檢出；呋喃西林代謝物(SEM)檢出8尾，檢出率11.1%，檢出平均濃度為(0.49±0.03)μg/kg；呋喃妥因代謝物(AHD)檢出32尾，檢出率44.4%，檢出平均濃度為(3.51±2.27)μg/kg。可以看出，部分秋冬季上市銷售的鱖體內含有硝基呋喃類藥物代謝物，尤其是AHD的殘留量與檢出率均較高。說明在鱖生產或流通中仍存在硝基呋喃違禁藥物使用現象。

2.3 喹諾酮類藥物

全年共抽檢鱖樣品72份，檢出率為76.39%(55/72)(表2)。其中，恩諾沙星檢出13尾，檢出率18.06%，檢出平均濃度為(27.95±4.17)μg/kg；環丙沙星檢出51尾，檢出率70.83%，檢出平均濃度為(20.98±6.85)μg/kg；諾氟沙星檢出7尾檢出率9.72%，檢出平均濃度為(25.52±10.36)μg/kg。從全年看，喹諾酮類藥物在4-9月份的檢出次數(45個)明顯高于其他月份(26個)，平均檢出濃度(26.74±5.11)μg/kg與其他月份相似(16.57±2.34)μg/kg。說明喹諾酮類藥物中，恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星可能有濫用或休藥期不足的風險。

2.4 亞甲基藍

全年共抽檢鱖樣品72份，檢出率為15.3%(11/72)(表2)。檢出平均濃度(123.5±10.1)μg/kg，說明存在亞甲基藍在水產養殖中使用的現象。因我國未限定亞甲基藍在魚類肌肉中的最高限量，故從亞甲基藍較高的檢出量推測，亞甲基藍在市售鱖的養殖、運輸以及銷售暫養環節均有可能被添加使用。但亞甲基藍的添加為單環節或多環節，還有待進一步探究。

3 討論

3.1 孔雀石綠檢測結果特征分析

孔雀石綠在水產養殖中主要用于防治水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等，且易被魚體迅速吸收到體內不同組織，并轉化為毒性大、易殘留的無色孔雀石綠[21]。有研究表明，鱖體內孔雀石綠、無色孔雀石綠完全消除分別需要58 d、270 d[22]，幾乎涵蓋了鱖從受精卵孵化到成魚上市的全部時長。本實驗中，上海市全年市售鱖肌肉中孔雀石綠和無色孔雀石綠均未被檢出，表明農業農村部的“三魚兩藥”專項整治行動，對解決鱖生產中孔雀石綠的違禁使用問題，效果極其顯著。

表2 上海市售鱖漁藥2018年4月-2019年3月間檢出情況Tab.2 Detection of Mandarin fish fishery drugs on sold in Shanghai market from April 2018 to March 2019 μg/kg

3.2 硝基呋喃類、喹諾酮類與亞甲基藍藥物的檢出特征分析

硝基呋喃類原藥在動物體內吸收迅速、代謝快、穩定時間短，停藥3 d就會低于檢測限，但其代謝物卻能夠與蛋白質穩定結合，長時間殘留在動物體內[23]。本實驗中，鱖肌肉中呋喃唑酮和呋喃它酮代謝物未有檢出，呋喃西林和呋喃妥因代謝物檢出率分別為11.1 %，44.4 %，說明在鱖養殖生產中仍存在少量硝基呋喃類藥物的違禁使用現象。值得注意的是，本次檢出樣品集中在當年10月份到下年4月份之間，該上市期的鱖包括一部分早繁鱖，養殖生產期經歷了夏秋高溫季節，容易引起各種寄生蟲病以及細菌性疾病的爆發[24]，因而，在養殖用藥中可能存在主動或被動使用違禁藥品的現象。這種季節性出現違禁藥物的現象，能夠為未來的生產監管提供重要線索和依據。

喹諾酮類藥物屬抗生素，水產養殖中的殘留易被消費者攝入，對人體產生健康風險[25]。本研究檢測了鱖肌肉中恩諾沙星、環丙沙星以及諾氟沙星三種喹諾酮類藥物的含量，其檢出率分別為：18.06%、70.83%、9.72%，該結果與煙臺市市售魚類[26]、杭州市市售魚類[27]相比，處于較高水平。喹諾酮類藥物作為限量藥物，允許在水產養殖中使用。但在實際使用中，其用藥量大小、用藥次數以及休藥期長短均難以控制。結果顯示，環丙沙星全年可檢出，恩諾沙星、諾氟沙星只在4-10月份之間檢出，同樣表現出季節性。一般4-10月份上市銷售的鱖多是上一年秋苗繁殖養殖而來，養殖生產期多為冬春季節，水溫較低，容易引起部分細菌的爆發[28,29]，為保持養殖成活率以獲取市場利潤，鱖生產階段可能存在藥物濫用或休藥期不足現象。

亞甲基藍在淡水養殖上可用于防治水霉病、紅嘴病、小瓜蟲病等。已有研究表明，15 mg/kg亞甲基藍藥浴異育銀鯽0.5 h，64 d后仍可在肌肉中檢測到亞甲基藍及其代謝物[12]，但中國目前對亞甲基藍在動物源性食品中的限量還沒有相關規定。本研究中，亞甲基藍檢出率15.3 %，分布在4～9月份，說明鱖的生產流通過程中存在亞甲基藍的使用現象，應引起注意。