人X染色質制備方法改進

王 劍，張錦萍，張中林

（遼寧醫藥職業學院，遼寧 沈陽 110101）

正常女性體細胞核中的一對X染色體在分裂間期只有一個有活性，呈常染色質狀態，另一個無活性，螺旋化呈異固縮狀態，緊貼核膜內緣，形成直徑約為1μm的橢圓形濃染小體，稱為X染色質，亦稱Barr小體（Barr body）[1]。該失活的X染色體可以來自父方，也可以來自母方，失活發生于胚胎發育第16天，一旦失活，那么由此細胞增殖產生的所有子代細胞也總是這一條X染色體失活[1]。間期核內X染色質數目等于X染色體數目減1，正常女性每個體細胞中應見到1個X染色質，正常男性體細胞中見不到X染色質。失活X染色體上的基因不是全部失活，一部分仍有轉錄活性，故個體X染色體數目異常者表型有別于正常個體[1]。因此，人X染色質的制備與觀察在臨床廣泛用于醫學需要的胎兒性別鑒定和性染色體數目異常疾病的診斷，是高職醫學遺傳學課程中的一個重要的教學實驗[2]。經過數輪教學實驗，我們對人X染色質的傳統制備方法加以改進，制片效果更好，且可縮短實驗時間，節約硫堇染液。

一、材料和方法

（一）器材

器材包括光學顯微鏡、擦鏡紙、水浴箱、載玻片、蓋玻片、清潔紗布、牙簽、滴管、吸水紙、紅藍鉛筆、染色缸、片架等。

（二）試劑

試劑包括香柏油、清潔劑（乙醚7份+無水乙醇3份）、70%乙醇、95%乙醇、蒸餾水、5 mol/L HCl溶液、硫堇染液等。

（三）方法

方法為乙醇固定法。受檢女性用清水漱口，以牙簽鈍端刮取口腔頰部粘膜表面上皮細胞（同一方向刮取幾行），棄去第一次刮取物，用第二次刮取物。用紅藍鉛筆在載玻片左側寫上編號或學號或姓名，中央畫出涂片范圍（直徑1 cm圓圈），將刮取的上皮細胞涂片（牙簽鈍端側面貼緊玻片滾動前行，涂完一行，同法涂下一行，不要來回涂抹，涂片范圍在所畫圓圈之內）。標本片稍晾干，置95%乙醇中固定20～30分鐘。取出標本片晾干，蒸餾水中漂洗3次（每次漂洗之后換水）。浸入30℃的5 mol/L HCl溶液中水解20～30分鐘，取出后蒸餾水中漂洗3次（即每次漂洗之后換水）。硫堇染液染色30分鐘（滴加1滴硫堇染液于所畫圓圈中央，輕輕晃動標本片使硫堇染液散布于所畫圓圈之內），然后在蒸餾水中漂洗3次（即每次漂洗之后換水）。70%乙醇中分色處理5分鐘，蒸餾水漂洗。加蓋片鏡檢，先在低倍鏡下選擇典型的細胞核，再轉換高倍鏡、油鏡，仔細尋找、觀察X染色質。

二、結果

低倍鏡下可見女性口腔黏膜上皮細胞核為圓形或橢圓形，染成紫藍色，選擇典型的細胞核應該是核較大，染色清晰，輪廓清楚無缺損。油鏡下觀察X染色質的特征是，緊貼核膜內側緣，染色深，輪廓清晰，呈圓形、扁平形、三角形或饅頭形，大小約 1.5μm （見圖 1）。

三、討論

人X染色質是女性在胚胎發育第16天，兩條X染色體中隨機一條發生異染色質化而失活，一旦失活，那么由此細胞增殖產生的所有子代細胞也總是這一條X染色體失活。失活X染色體上的基因不是全部失活，一部分仍有轉錄活性，故個體X染色體數目異常者表型有別于正常個體。間期核內X染色質數目等于X染色體數目減1，正常女性每個體細胞中應見到1個X染色質，正常男性體細胞中見不到X染色質。

圖1 人X染色質（油鏡下）

XO女性：體細胞核中觀察不到X染色質，臨床表現為身材矮小，身高一般低于150厘米；生殖器與第二性征不發育，女性外陰發育幼稚、有陰道、子宮小或缺如，乳頭間距大、乳房及乳頭均不發育；軀體發育異常，多痣、眼瞼下垂、耳大位低、腭弓高、后發際低、頸短而寬、胸廓桶狀或盾形等，智力發育程度不一，壽命與正常人同。XXX女性體細胞核中可見到兩個X染色質，一般發育正常，但智力低下，外生殖器無異常，性腺發育不良，大多卵巢內有正常卵泡，部分患者有小子宮。

XXY男性體細胞核中可觀察到一個X染色質，患者表現為睪丸小而硬、曲細精管纖維化、透明樣變，管腔閉塞，無精子發生，男性第二性征發育差，有女性化表現，如無胡須、體毛少、陰毛分布如女性、陰莖龜頭小等，約25%的患者有乳房發育、身材高、四肢長、部分智力低下，有的精神異常有精神分裂癥傾向。

隨著對X染色質深入研究，如劑量補償作用[3]、XIST RNA與X染色質共域[4]等，X染色質異常與疾病的關系將逐漸被揭示。人X染色質的制備與觀察可用于鑒定醫學需要的胎兒性別和診斷性染色體數目異常的疾病，廣泛應用于臨床，也是醫學遺傳學一個重要的教學實驗。

我們按照傳統制備方法經過幾輪教學實驗，發現效果不太理想，而且4學時的實驗課時間也不太充足，于是我們查閱文獻資料發現，目前X染色質制備方法有涂片法和滴片法[5]兩大類。染色方法有Giemsa染色、甲苯胺藍染色[6]、石炭酸復紅染液染色[7]、硫堇染色[8-10]等。我們選擇對人X染色質的傳統制備方法[11]（涂片法-硫堇染色）進行改進，利用課余時間多次摸索，改進之后，制片效果更好，且可縮短實驗時間，節約硫堇染液。

一是涂片方法的改進：傳統方法將刮取的上皮細胞涂在潔凈的載玻片上，平推成薄層細胞平鋪片。而平推不易使得細胞單層均勻鋪開，易造成有的地方細胞比較分散，有的地方細胞重疊，故觀察效果不理想。我們對涂片方法加以改進，以牙簽鈍端側面貼緊玻片滾動前行，使細胞單層均勻鋪開在紅藍鉛筆預先畫好的直徑1 cm圓圈范圍之內，涂完一行，同法再涂下一行，不要來回涂抹。

二是染片方法的改進：傳統方法將標本片不重疊擺放于平皿內，加硫堇染液沒過標本片染色，這樣需要的硫堇染液比較多，造成浪費（如果將標本片插入片架置于染缸內染色，所需硫堇染液更多很多）。我們將硫堇染液裝入小塑料滴瓶中，每張標本片滴加1滴硫堇染液于所畫圓圈中央，輕輕晃動標本片使硫堇染液散布于所畫圓圈之內，如此染片所需硫堇染液大大減少，節約很多，而且整張標本片很干凈，也便于之后蒸餾水漂洗。

三是分色時間的改變：傳統方法硫堇染液染色30分鐘后，蒸餾水洗3次，50%乙醇中漂洗1次，70%乙醇中分色處理15～30分鐘，蒸餾水漂洗，然后初步鏡檢：若染色過深，繼續分色；若染色過淺，則放硫堇染液中再染。經過幾輪教學實驗，我們發現分色太過，觀察效果不太理想，如果繼續染色，4學時的實驗課時間又不太充足，于是我們利用課余時間多次摸索，確定70%乙醇中分色處理5分鐘即可，然后蒸餾水漂洗，加蓋片鏡檢。學生實驗課如此制備X染色質，絕大多數觀察都比較理想，先在低倍鏡下選擇較大、染色清晰、輪廓清楚無缺損的典型細胞核，再轉換高倍鏡、油鏡，可以觀察到緊貼核膜內側緣、染色深、輪廓清晰、呈圓形、三角形或饅頭形的X染色質，提高了實驗教學效果，為人X染色質的制備實驗臨床和教學提供參考。