松褐天牛腸道微生物的分離與鑒定

謝谷艾，金明霞，喻愛林，涂業(yè)茍，闕生全，熊彩云，劉曉華，賀義昌

松褐天牛腸道微生物的分離與鑒定

謝谷艾1,2，金明霞2,3*，喻愛林2，涂業(yè)茍2，闕生全2，熊彩云2，劉曉華2，賀義昌1,2

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045；2. 江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330013；3. 南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210000）

松褐天牛又名松墨天牛，它不但能鉆蛀松樹，而且成蟲還會(huì)傳播對(duì)松樹致命的病害——松材線蟲病。松褐天牛被列為國(guó)際、國(guó)內(nèi)檢疫性害蟲。松褐天牛身上所攜帶的松材線蟲是我國(guó)南方馬尾松等松樹的重要危害源，其致病能力強(qiáng)、傳播速度快、治理難度大。作為松褐天牛寄宿的主要對(duì)象——馬尾松中缺乏氮素，所以其腸道中存在著能由其他渠道獲取氮素的菌群。據(jù)研究腸道菌群在營(yíng)養(yǎng)供給、消化及吸收上起到了至關(guān)重要的作用，并通過這種方式影響松褐天牛的生長(zhǎng)發(fā)育。研究通過涂布法和劃線法分離菌落，使用無氮培養(yǎng)基以及生理生化檢測(cè)的方法，研究松褐天牛幼蟲腸道微生物的種類。從因松材線蟲病致死的馬尾松樹干中采集活體松褐天牛幼蟲進(jìn)行人工培養(yǎng)后解剖，將其腸道制成勻漿后利用Ashby無氮培養(yǎng)基篩選出天牛幼蟲腸道中的固氮菌，分離純化，并進(jìn)行生理生化檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)（中文第八版）》比照得出從松褐天牛幼蟲腸道中提取的菌中有腸桿菌屬(Hormaeche and Edwards, 1960)、氣球菌屬(Williams,Hitch and Cowan, 1953)、檸檬酸桿菌屬(Werkman and Gillen, 1932)、固氮菌屬（）、埃希氏菌屬(Castellani and Chalmers, 1919)、克雷伯氏菌屬（）、沙雷氏菌屬(, 1823)、氮單胞菌屬(Winogradsky, 1938)、愛德華氏菌屬(Ewing and McWhorter,1965)，通過研究松褐天牛腸道固氮微生物的菌屬可有針對(duì)性的尋找抑制其活性的藥劑以達(dá)到防治蟲害的目的。此種方法具有專一、綠色等優(yōu)點(diǎn)，在殺滅害蟲的同時(shí)對(duì)其他動(dòng)植物影響小。

松褐天牛；菌種篩選；腸道固氮菌；生理生化測(cè)試

松褐天牛又名松墨天牛(Hope)、松天牛，隸屬于鞘翅目(Coleoptera)，天牛科(Cerambyeidae)，溝脛天牛亞科(Lamiinae)，墨天牛屬()[1]。廣泛分布于我國(guó)各地，其集中分布于南方及西南方各省市[2]。松褐天牛成蟲會(huì)啃食松樹幼嫩的樹枝和樹皮，松褐天牛幼蟲會(huì)鉆蛀松樹的樹干，從而導(dǎo)致松樹的枯萎。不僅如此，成年松褐天牛身上所攜帶松材線蟲還會(huì)傳播對(duì)松樹致死的松材線蟲病。有研宄表明攜帶松材線蟲松褐天牛的比例高達(dá)30%[3]。松褐天牛和其傳播的松材線蟲病使得超過1.4×106株松樹死亡，僅2005年發(fā)生面積就達(dá)7.7 hm2，嚴(yán)重威脅著我國(guó)林業(yè)的健康發(fā)展[4]。所以有效防治松褐天牛迫在眉睫。

為了尋求對(duì)松褐天牛的有效防治方法和措施，不同學(xué)者已從松褐天牛的生物學(xué)特性、生態(tài)學(xué)特征及其生理生化等多個(gè)角度開展研究[5]。隨著技術(shù)發(fā)展，人們對(duì)生物腸道微生物的研究越來越多。研究表明腸道共生菌可為宿主提供營(yíng)養(yǎng)、必須氨基酸和消化食物等方面起重要作用[6-7]。以往的研究結(jié)果為筆者了解腸道細(xì)菌和松褐天牛之間的關(guān)系提供了參考，但對(duì)于松褐天牛腸道內(nèi)的固氮菌的研究還未見報(bào)道，對(duì)腸道固氮菌的研究不僅為開發(fā)新的害蟲控制策略提供幫助，也為開發(fā)新的固氮微生物資源提供了可能。

日本學(xué)者最早對(duì)松褐天牛的生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性，發(fā)生規(guī)律進(jìn)行過較深入研究[7]。有文獻(xiàn)表明，我國(guó)境內(nèi)越往東南部，其種群密度越大，越向西北，隨海拔高度及緯度的增加松褐天牛的種群數(shù)量漸少[8]。松材線蟲病從1982年在南京首次發(fā)現(xiàn)至今，疫區(qū)范圍擴(kuò)大到江蘇、浙江和江西等14省區(qū)，累計(jì)致死松樹5億多株，毀滅松林超30萬hm2，造成經(jīng)濟(jì)損失上千億元，對(duì)生態(tài)安全構(gòu)造嚴(yán)重威脅[9]。松褐天牛是以缺乏氮素營(yíng)養(yǎng)的木材為食，是寡氮營(yíng)養(yǎng)型昆蟲，木材含氮量極低，一般為0.1%以下，碳氮比值約1 000∶1，而且，木頭中大多數(shù)可用的氮主要以頑固的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)糖蛋白形式存在，一些以生物堿的形式存在，僅有0.001%的可用氮以游離氨基酸形式存在。因此，限制性氮對(duì)松褐天牛來說是一個(gè)特別極端的營(yíng)養(yǎng)障礙。松褐天牛的天敵防治主要是通過生物間食物鏈，利用捕食性、寄生性天敵和病原微生物進(jìn)行有效控治[10]。近代以來，隨著微生物生態(tài)學(xué)技術(shù)的日趨完善和發(fā)展，昆蟲腸道菌群和腸道微生態(tài)系統(tǒng)的研究進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段，對(duì)于以昆蟲腸道微生態(tài)和腸道微生物研究為核心的害蟲防控方法的探索也正在成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一[11]。

1 材料與方法

1.1 天牛幼蟲腸道菌解剖材料及試劑

試供天牛幼蟲為劈開受感染的馬尾松樹干中采集，以松木屑進(jìn)行飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前停止喂食12 h，使其排空腸道內(nèi)食物殘?jiān)?/p>

試劑：75%乙醇，去離子水，0.1 mol/L pH值7.0的磷酸鹽緩沖液。

工具：超凈工作臺(tái)，體視顯微鏡，蠟盤，尖頭鑷子，50 mL燒杯，手術(shù)剪刀，昆蟲針，研缽，無菌紗布，膠頭滴管，1 500 μL微量離心管(均為同規(guī)格微量離心管)，1 000 μL移液槍，200 μL移液槍。

1.2 腸道固氮菌生理生化測(cè)試材料及試劑

（1）革蘭氏染色劑。甲液：結(jié)晶紫2 g溶于20 mL乙醇（95%）；乙液：草酸銨0.8 g溶于80 mL去離子水；使用時(shí)將甲液與乙液充分混勻后染色。（2）革蘭氏碘液。碘1 g；碘化鉀2 g；去離子水300 mL，先將碘化鉀溶于去離子水中然后再加入碘，用玻璃杯攪拌至碘完全溶解，貯存于棕色磨口試劑瓶中避光保存。（3）革蘭氏復(fù)染劑。藏紅O溶液（2.5%的藏紅O 95%乙醇溶液）10 mL溶于100 mL去離子水中。（4）糖酵解試驗(yàn)。溴麝香草酚藍(lán)0.2 g；1 mol/L氫氧化鈉5 mL；去離子水95 mL。（5）硝酸鹽還原試驗(yàn)。甲液：對(duì)氨基苯磺酸0.8 g；5 mol/L醋酸溶液100 mL。乙液：α-萘胺0.5 g；5 mol/L醋酸溶液100 mL。（6）M.R試驗(yàn)。將0.1 g甲基紅溶于300 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇中，再加入200 mL去離子水。（7）V.P試驗(yàn)。0.3%肌酸，40%氫氧化鈉溶液。（8）吲哚試驗(yàn)。對(duì)二甲基氨基苯甲醛1 g；乙醇95 mL；37%~38%濃鹽酸20 mL；先將對(duì)二甲基氨基苯甲醛溶于乙醇中后緩慢加入濃鹽酸，置于棕色試劑瓶中避光保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

SW-CJ-2G凈化工作臺(tái)、KYC-1102C恒溫培養(yǎng)搖床、GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱、WH-2微型旋渦混合儀、SPX-150BⅢ生化培養(yǎng)箱、RGX-250E人工氣候箱、BK-300生物顯微鏡、XTL-330體視顯微鏡、立式壓力蒸汽滅菌鍋、艾柯超純水機(jī)和海爾特種冰箱。

1.4 菌種物理性質(zhì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 松褐天牛幼蟲解剖及腸道勻漿的制作 步驟：在超凈工作臺(tái)中將天牛幼蟲用清水洗凈后浸入75%乙醇中2~3 min以殺死幼蟲，用去離子水清洗幼蟲表面3遍。用手術(shù)剪沿著松褐天牛幼蟲的體側(cè)線小心剪開，并用昆蟲針刺穿其頭部使其固定在蠟盤上。在體視鏡下用尖頭鑷子從幼蟲肛門位置將幼蟲表皮撕開并小心剝離其脂肪使消化道暴露，可用微量生理鹽水沖洗幼蟲腸道以洗去黏著在腸道上的脂肪，用尖頭鑷子小心將其腸道與其脂肪分離并從幼蟲的頭部和肛門處截?cái)鄬⑼暾哪c道取下。因注意在分離腸道與脂肪時(shí)不要將腸道從中間扯斷。（1）勻漿液的制作：迅速將幼蟲腸道完整取出置于研缽中滴入磷酸緩沖液進(jìn)行研磨。（2）取勻漿液1 000 μL作為0號(hào)勻漿，迅速加入去離子水10倍梯度稀釋至10-7備用，既得松褐天牛腸液。

1.4.2 腸道菌的分離與純化 本實(shí)驗(yàn)使用的是Ashby培養(yǎng)基來篩選與培養(yǎng)腸道勻漿中有固氮作用的菌類。磷酸氫二鉀0.2 g；碳酸鈣5 g；七水合硫酸鎂0.2 g；葡萄糖10 g；氯化鈉0.2 g；二水合硫酸鈣0.1 g；瓊脂18 g；去離子水1 000 g將上述混合后調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min（加熱時(shí)需要不斷攪拌碳酸鈣防止糊底，滅菌取出培養(yǎng)基之后也要將碳酸鈣搖勻）。在超凈工作臺(tái)中倒平板，每皿約20 mL培養(yǎng)基。

在超凈工作臺(tái)中用200 μL移液槍吸取10-1，10-3，10-5，10-7的腸道勻漿各100 μL于培養(yǎng)基上用玻璃涂布器涂布接種，每個(gè)濃度各2個(gè)平板置于人工氣候箱中30 ℃倒置培養(yǎng)一周。待平板上長(zhǎng)出菌落后在超凈工作臺(tái)中挑取表征各異的菌落在培養(yǎng)基平板上劃線、純化、培養(yǎng)，重復(fù)上述步驟直至平板中菌的形態(tài)為單菌落。將純化后的菌落分別標(biāo)號(hào)。

1.5 菌種生理生化測(cè)試

（1）氧化酶活性測(cè)試。試劑：鹽酸二甲基對(duì)苯撐二胺。步驟：將濾紙剪成長(zhǎng)條型置于潔凈的培養(yǎng)皿中，滴加1%鹽酸二甲基對(duì)苯撐二胺溶液使濾紙略濕潤(rùn)。用鉑絲挑取少量純化的單菌落涂抹在被試劑潤(rùn)濕的濾紙上，若在短時(shí)間內(nèi)濾紙變紅則為陽性反之則為陰性。

委員會(huì)調(diào)查中最有意義的發(fā)現(xiàn)之一來自對(duì)相對(duì)新的、未開發(fā)的數(shù)據(jù)集——三角測(cè)量臺(tái)網(wǎng)畸變的分析。美國(guó)海岸與大地測(cè)量局的J.F.Hayes和A.L.Baldwin在震后15個(gè)月內(nèi)復(fù)測(cè)了加州北部三角臺(tái)網(wǎng)的大部分。他們的細(xì)致分析（Ⅰ卷，114～145頁）證明了1868年海沃德斷層地震和1906年地震都出現(xiàn)位移的證據(jù)。對(duì)于1906年地震，他們發(fā)現(xiàn)同震水平位移與圣安德烈斯斷層大致平行，斷層兩側(cè)的點(diǎn)朝相反的方向移動(dòng)，與所觀察到的右旋斷錯(cuò)一致。他們進(jìn)一步總結(jié)出，位移量隨著離開斷層的距離呈非線性方式減小，且斷層附近減小最快（圖2）。

（2）過氧化氫酶活性測(cè)試。試劑：3%過氧化氫。步驟：用1 000 μL移液槍向1.5 mL微量離心管中移1 000 μL的過氧化氫溶液，用鉑絲蘸取少量菌落插入離心管中。若鉑絲上出現(xiàn)氣泡則為陽性反之為陰性。

（3）苯丙氨酸脫氨酶活性測(cè)試。培養(yǎng)基：酵母膏3 g；氯化鈉5 g；磷酸氫二鈉1 g；DL-苯丙氨酸2 g；瓊脂12 g；去離子水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌10 min，倒試管斜面。試劑：10%氯化鐵溶液。接種與培養(yǎng)：將菌種接種于試管斜面上置于人工氣候箱中37 ℃培養(yǎng)8~24 h后測(cè)定。結(jié)果觀察：用膠頭滴管將氯化鐵溶液滴加到斜面上，當(dāng)斜面上溶液變?yōu)榫G色時(shí)為陽性，即表明已經(jīng)生成了苯丙酮酸，不變色則為陰性。

（4）鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶活性測(cè)試。培養(yǎng)基：蛋白胨5 g；葡萄糖1 g；0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液12 mL；去離子水1 000 mL，調(diào)pH到6.8，每1 000 mL培養(yǎng)基中加入所需要測(cè)定的氨基酸5 g，所加的氨基酸需要先溶解于15%的氫氧化鈉中。L-d 賴氨酸5 g+15%氫氧化鈉溶液5 mL；L-d鳥氨酸5 g+15%氫氧化鈉溶液6 mL；精氨酸5 g+15%氫氧化鈉溶液5 mL。加入所測(cè)的氨基酸之后再次調(diào)pH至6.8，121 ℃高壓蒸汽滅菌10 min。

接種與培養(yǎng)：用1 000 μL移液槍各吸取1 000 μL培養(yǎng)基分裝于無菌的微量離心管中，用鉑絲接種環(huán)接種。（36±1）℃培養(yǎng)18~24 h。結(jié)果觀察：若培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色則說明氨基酸脫羧產(chǎn)生了堿性物質(zhì)為陽性，若培養(yǎng)基變?yōu)辄S色則說明無堿性物質(zhì)產(chǎn)生，但葡萄糖分解產(chǎn)酸使溴麝香草酚藍(lán)變黃為陰性。

（5）硝酸鹽還原試驗(yàn)。培養(yǎng)基：蛋白胨1 g；葡萄糖0.2 g；0.2%溴麝香草酚藍(lán)5.4 mL；去離子水200 mL調(diào)pH至7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌10 min，每管4~5 mL分裝于試管中。接種與培養(yǎng)：將測(cè)定菌接種于硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，（35±2）℃培養(yǎng)3 d。結(jié)果觀察：取潔凈的試管用1 000 μL移液槍取培養(yǎng)液與甲、乙液各1 000 μL加入試管中。若溶液出現(xiàn)紅色、瑰紅、棕紅等顏色則表示亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性，若無紅色出現(xiàn)則為陰性。

（6）吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)。培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨水溶液，調(diào)pH至7.4±0.2，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min分裝于試管中。接種與培養(yǎng)：28 ℃恒溫培養(yǎng)2或3 d，當(dāng)培養(yǎng)液長(zhǎng)菌明顯渾濁后，沿試管壁緩慢加入少量對(duì)二氨基甲基苯甲醛試劑。結(jié)果觀察：若在溶液分層處出現(xiàn)紅色則為陽性，無色則為陰性。若顯色不明顯可加入4~5滴乙醚后搖動(dòng)，使乙醚分散于液體中萃取培養(yǎng)液中的吲哚后靜置，待乙醚與培養(yǎng)液分層后用膠頭滴管緩慢加入對(duì)二氨基甲基苯甲醛試劑。若培養(yǎng)液中有吲哚時(shí)，吲哚可被乙醚提取至上層，使顯色反應(yīng)更明顯。

（7）M.R試驗(yàn)。培養(yǎng)基：蛋白胨1 g；葡萄糖1 g；磷酸氫二鉀1 g；去離子水200 mL，調(diào)pH至7.0~7.2，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min后分裝于試管中。接種與培養(yǎng)：用接種環(huán)將試驗(yàn)菌接種于培養(yǎng)液中，（36±1）℃培養(yǎng)2~6 d。結(jié)果觀察：在培養(yǎng)液中用膠頭滴管滴加少量甲基紅試劑，若培養(yǎng)液為紅色則為陽性，黃色則為陰性。

（8）V.P試驗(yàn)。培養(yǎng)基，接種與培養(yǎng)：與M.R試驗(yàn)相同。結(jié)果觀察：用移液槍取等量培養(yǎng)液與氫氧化鈉溶液后加入少許肌酸，若培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色則為陽性，反之為陰性。

（9）明膠液化試驗(yàn)。培養(yǎng)基：蛋白胨2.5 g；牛肉膏1.5 g；明膠60 g；去離子水500 mL，調(diào)pH7.0~7.2 121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，分裝試管。接種與培養(yǎng)：取待試驗(yàn)菌穿刺接種于明膠斜面中，并留兩支未接種的試管做空白對(duì)照。20 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)3~5 d。結(jié)果觀察：如明膠表面長(zhǎng)有菌落但是明膠表面無凹陷且為穩(wěn)定的凝塊則為陰性，反之為陽性（若明膠不凝結(jié)可以放入冰箱中降溫使其凝結(jié)后取出）。

（10）糖酵解試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中所測(cè)試的糖類有：葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、海藻糖、棉籽糖、半乳糖。培養(yǎng)基：蛋白胨2 g；氯化鈉5 g；磷酸氫二鉀2 g；瓊脂5 g；1%溴麝香草酚藍(lán)溶液3 mL；所測(cè)糖類5 g(乳糖為7.5 g)；去離子水500 mL。將蛋白胨、鹽、瓊脂、水先混勻，加熱融化后加入所測(cè)糖類，調(diào)pH7.2±0.2，最后加入溴麝香草酚藍(lán)溶液。121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min分裝于試管中做高層。接種與培養(yǎng)：用接種針穿刺接種于高層中，每株菌做4組。35 ℃培養(yǎng)2 d觀察結(jié)果。結(jié)果觀察：若培養(yǎng)基中指示劑變黃產(chǎn)酸為陽性；培養(yǎng)基仍為藍(lán)色則為陰性。

（11）醇類發(fā)酵試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中所測(cè)試的醇類有：甘露醇、山梨醇、肌醇。培養(yǎng)基及接種培養(yǎng)方法同糖類發(fā)酵。結(jié)果觀測(cè)：若培養(yǎng)基中指示劑變黃則為陰性，培養(yǎng)基仍為藍(lán)色則為陽性。

（12）淀粉水解試驗(yàn)。培養(yǎng)基：可溶性淀粉15 g；瓊脂7.5 g；去離子水500 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min倒平板。接種與培養(yǎng)：用接種絲在挑取待測(cè)試菌落劃線法接種，置于恒溫培養(yǎng)箱中35 ℃培養(yǎng)2~5 d。結(jié)果觀察：在平板上滴加革蘭氏碘液使平板變?yōu)樗{(lán)黑色。若菌落周圍出現(xiàn)透明圈則說明其有分解淀粉的能力，為陽性。若無透明圈出現(xiàn)則為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 天牛腸道菌形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果

2.1.1 腸道菌的物理性質(zhì) 本次實(shí)驗(yàn)共解剖3批松褐天牛幼蟲，分別制作腸道勻漿并采取劃線分離法篩選菌株后純化，并從其中挑選出9種形態(tài)、性狀各異的菌落。從第一批天牛幼蟲腸道中挑選出0、3、3’、5、5’這5支菌株，從第二批天牛幼蟲腸道中挑選出5-a、5-b、5-b’這3支菌株，從第三批天牛幼蟲腸道中挑選出3~這1支菌株，共9只菌株，分別標(biāo)號(hào)1~9號(hào)便于記錄，如圖1所示。

圖1 天牛幼蟲腸道菌菌形態(tài)觀測(cè)結(jié)果

2.1.2 腸道菌革蘭氏染色結(jié)果 將上述9支菌保存在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并批量接種，待純化菌在培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出明顯菌落時(shí)觀察其形態(tài)特征，并做革蘭氏染色。染色結(jié)果如圖2。

圖2 天牛幼蟲腸道菌的革蘭氏染色檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)宏觀觀測(cè)菌落形態(tài)特征及革蘭氏染色后使用顯微鏡油鏡觀察后得到結(jié)果如表1所示。

表1 細(xì)菌形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀表

2.2 天牛腸道菌生理生化測(cè)試結(jié)果

表2 松褐天牛腸道微生物生理生化測(cè)試結(jié)果

“+”: 陽性；“-”: 陰性

2.3 腸道菌鑒定結(jié)果

根據(jù)從松褐天牛幼蟲腸道分離出固氮菌株的菌株性狀、菌落形態(tài)、革蘭氏染色、生理生化檢測(cè)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）[13]。將上述1~9號(hào)共計(jì)9個(gè)菌株分別鑒定為腸桿菌屬(Hormaeche and Edwards, 1960)、氣球菌屬(, Hitch and Cowan, 1953)、檸檬酸桿菌屬(Werkman and Gillen, 1932)、固氮菌屬（）、埃希氏菌屬(Castellani and Chalmers, 1919)、克雷伯氏菌屬（）、沙雷氏菌屬(,1823)、氮單胞菌屬(Winogradsky, 1938)、愛德華氏菌屬(Ewing and McWhorter, 1965)。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

在針對(duì)目前松木重要病蟲害對(duì)象松褐天牛幼蟲其腸道固氮微生物的研究，提出通過松褐天牛生長(zhǎng)繁殖所必須依賴的腸道固氮菌群的特性從基因工程來找開口以尋求改造其腸道固氮菌群的特性來防治松褐天牛。

現(xiàn)研究結(jié)果如下：（1）本次實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的菌株在無氮培養(yǎng)基中無氮素，所以細(xì)菌在無氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)只能通過固定空氣中的氮?dú)鈦硖峁┥L(zhǎng)繁殖所必須的氮素。（2）本研究通過研究松褐天牛幼蟲腸道菌群，并全程使用Ashby培養(yǎng)基無氮培養(yǎng)基來篩選、培養(yǎng)從幼蟲腸道中得到9支菌株。（3）通過單菌落形態(tài)、革蘭氏染色以及生理生化測(cè)試鑒定結(jié)果為腸桿菌屬(Hormaeche and Edwards, 1960)、氣球菌屬(Williams, Hitch and Cowan, 1953)、檸檬酸桿菌屬(Werkman and Gillen, 1932)、固氮菌屬（）、埃希氏菌屬(Castellani and Chalmers, 1919)、克雷伯氏菌屬（）、沙雷氏菌屬(, 1823)、氮單胞菌屬(Winogradsky, 1938)、愛德華氏菌屬(Ewing and McWhorter, 1965)。這幾種菌均和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）中描述大體一致。

3.2 討 論

本次實(shí)驗(yàn)中從天牛幼蟲腸道獲得的菌株并不是一次性采集完全，而是分了3批不同時(shí)間段的天牛各5只，以消除個(gè)體差異。但3次采集的結(jié)果大體相同只有少數(shù)菌株存在差異，說明松褐天牛幼蟲腸道中所存在的固氮菌是普遍存在的。

為排除無氮培養(yǎng)基中的菌是來自于松褐天牛幼蟲腸道勻漿中，每次在分離與純化過程中設(shè)置了一個(gè)空白對(duì)照皿并置于空氣中暴露[15]。結(jié)果空白對(duì)照培養(yǎng)皿鮮有染菌，僅有的一次空白皿所染的也是霉菌，繼續(xù)培養(yǎng)一周后并無出現(xiàn)細(xì)菌的菌落。

將所得的固氮菌從Ashby培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移至普通的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周后發(fā)現(xiàn)部分固氮菌的形態(tài)特征發(fā)生了變化，接種回Ashby培養(yǎng)基后又變回原來的形態(tài)。推測(cè)可能是因?yàn)樵谂Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基中有充足的氮素，所以該菌的其他形狀得以表達(dá)。

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Isolation and Identification of Microbe in the Intestinal Tract of Pine Sawyer

XIE Gu-ai1,2, JIN Ming-xia2,3*, YU Ai-lin2, TU Ye-gou2, QUE Sheng-quan2, XIONG Cai-yun2, LIU Xiao-hua2, HE Yi-chang1,2

(1. College of Agronomy, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2. Jiangxi Academy of Forestry, Nanchang 330013, China; 3. College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing 210000, China)

Pine sawyer is also known as the pine inks. It can not only drill a pine tree, and its adults can also spread the deadly disease of pine trees, Pine wood nematode disease. So, it is listed as an international and domestic quarantine pest. Pine wood nematode carried onis an important source of damage to pine trees such asin the south of China. Its virulence is strong，with fast transmission speed, and so it is difficult to govern. The main object of the lodging of the pine brown beetles is the lack of nitrogen in, and so there are bacteria in the intestines that can fix nitrogen from the air. According to the study, intestinal flora has played a crucial role in the digestion and absorption of nutrient supply, and by this way influences’s development and health. Through isolation and culture with traditional identification methods, this article studied the species of intestinal microbes in the larva of. First, the larva ofwere collected from the trunk ofkilled by pine wood nematode disease and dissected after artificial culture. The nitrogen fixing bacteria in the intestines of the larva of the cattle were screened and purified by Ashby nitrogen free medium after making the homogenate of the intestine, and physiological and biochemical tests were carried out. Result references were Common bacterial system identification manual and Berger Bacterial Identification Manual (Eighth Chinese Edition). To achieve the purpose of determining the category to which it belonged, the manual test results and the identification of bacteria Berger (Eighth Edition) were used to get the following as, (Hormaeche and Edwards, 1960), and gas aureus (Williams, Hitch and Cowan, 1953),(Werkman and Gillen, 1932),genera (), Mr Bush’s bacteria (Castellani and Chalmers, 1919), and(), serratia (, 1823), nitrogen is a bacterium (Winogradsky, 1938), Edward's bacteria genera (Ewing and Mr McWhorter, 1965). By studying the bacteria of the nitrogen fixing microorganisms in the intestinal tract of the pine Brown sky, the bacteria could be targeted to find the agent to inhibit the activity of the bacteria in order to prevent and control the insect pests. This method had concentrated and organic advantages, and had little effect on other animals and plants while killing pests.

pine sawyer; strain screening; intestinal azotobacter; physiological and biochemical responses

S763.38

A

2095-3704（2020）01-0040-08

2020-01-10

江西省林業(yè)科學(xué)院青年人才培養(yǎng)項(xiàng)目（2017522501，2018521601）、江西省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（201613）和江西省林業(yè)科學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目（2016512501）

謝谷艾（1992—），男，助理研究員，博士生，主要從事森林保護(hù)研究，378269742@qq.com；*通信作者：金明霞，副研究員，博士生，370686315@qq.com。

謝谷艾, 金明霞, 喻愛林, 等. 松褐天牛腸道微生物的分離與鑒定[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2020, 43(1): 40-47.

10.3969/j.issn.2095-3704.2020.01.09