油茶炭疽病拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選及鑒定

張林平，張儀平，陳 靜，高一欣，陳言柳，吳 斐，郭春蘭

油茶炭疽病拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選及鑒定

張林平1，張儀平2，陳 靜1，高一欣2，陳言柳1，吳 斐1，郭春蘭1

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 鄱陽湖流域森林生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與修復(fù)國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2. 江西省貴溪市林業(yè)局，江西 貴溪 335400）

從健康的油茶葉中分離得到內(nèi)生細(xì)菌菌株125株，經(jīng)平板對峙法初篩，篩選出對油茶炭疽病病菌有抑制作用內(nèi)生細(xì)菌23株，再通過發(fā)酵法復(fù)篩，篩選到6株具有強(qiáng)拮抗作用的菌株。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測定及16S rDNA序列分析等方法，將Y55和Y57鑒定為，Y56鑒定為，Y76鑒定為sp.，Y77鑒定為，Y112鑒定為sp.。

油茶；拮抗內(nèi)生細(xì)菌；炭疽病；生物防治

油茶（Abel），系山茶科（Theaceae）山茶屬（）常綠小喬木或灌木，是我國亞熱帶地區(qū)特有的木本食用油料樹種[1]。油茶適種于廣大紅壤丘陵低海拔地區(qū)[2]。長期食用茶油可降血壓、降血脂，預(yù)防心血管疾病[3]，油茶還可作為機(jī)械潤滑油、防銹油等生產(chǎn)原料。此外，油茶樹在凈化空氣、保持水土、涵養(yǎng)水源、抗污染等方面具有很強(qiáng)的能力[4]。由于日益受到消費(fèi)者的青睞和能源危機(jī)突顯，國家十分重視油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，到2020年我國油茶種植面積可達(dá)4.667×107hm2，茶油產(chǎn)量可達(dá)2.5×107t，可見，我國油茶產(chǎn)業(yè)迎來了難得的快速發(fā)展機(jī)遇。同時，油茶病害的發(fā)生程度突顯嚴(yán)重，嚴(yán)重制約了油茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[5]。目前對油茶病害的防治仍以化學(xué)防治為主，但由此引發(fā)農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、產(chǎn)生抗藥性等一系列問題，嚴(yán)重影響了茶油質(zhì)量和食品安全。因此，要實(shí)現(xiàn)油茶高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、綠色無公害，有必要從不同生態(tài)環(huán)境中分離、篩選有益微生物，這是解決油茶病害防治的重要途徑之一。

當(dāng)前，油茶產(chǎn)區(qū)中油茶炭疽病是主要病害之一。本研究擬從油茶健康植株葉片分離出內(nèi)生細(xì)菌，通過平板對峙法和發(fā)酵液復(fù)篩法篩選出對油茶炭疽病菌具有強(qiáng)烈抑制作用的菌株，并對拮抗內(nèi)生菌株進(jìn)行鑒定，為油茶炭疽病生物防治研究提供理論依據(jù)和優(yōu)良菌株。

1 材 料

1.1 供試樣品

供試樣品于2018年9月從宜春市江西星火油茶科技示范園內(nèi)采集5~6 a生的健康油茶植株葉片，裝入自封袋，并帶回實(shí)驗(yàn)室置于4 ℃冰箱，48 h內(nèi)完成分離。油茶炭疽病菌（），菌株由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護(hù)教研室分離并保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：葡萄糖18 g，馬鈴薯200 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH；NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蛋白胨10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 m，pH 7.2~7.4。

2 方 法

2.1 油茶內(nèi)生細(xì)菌的分離

采用組織塊分離法隨機(jī)挑選從宜春油茶基地采集回來形態(tài)正常、無病蟲害、色澤正常的油茶葉片適量，用自來水沖洗干凈，晾干。在體積分?jǐn)?shù)75%酒精中浸泡90 s，然后再在體積分?jǐn)?shù)3.5%次氯酸鈉中浸泡180 s，最后用體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡45 s，取出后用無菌水沖洗3~4次，用滅菌的濾紙將葉面水分吸干，剪成2 mm×2 mm大小的組織塊。每個含有NA培養(yǎng)基的平板內(nèi)放置5個組織塊，共40皿，放置于28 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。以最后一次清洗完油茶葉的無菌水涂布于NA培養(yǎng)基作為CK對照，3 d后培養(yǎng)基上無菌落形成，表明材料表面消毒徹底，組織塊上長出的菌落則為內(nèi)生細(xì)菌，菌株純化后保存。

2.2 拮抗細(xì)菌的篩選

（1）平板對峙法初篩。用移液槍取1 mL已滅菌的NA液體培養(yǎng)基至1.5 mL的離心管中，用挑針蘸取待測細(xì)菌至離心管中28 ℃搖培2 d，制得細(xì)菌懸浮液。將油茶炭疽病菌于PDA培養(yǎng)基平板上活化后，用直徑為6 mm的打孔器在平板外緣隨機(jī)打孔成菌餅，將菌餅挑至固體PDA平板中央，用移液槍取5 μL搖培后的待測細(xì)菌的懸浮液等距離（距炭疽菌菌餅2.5 cm）對稱點(diǎn)接，以只接菌餅的培養(yǎng)基為空白對照，每個處理3個重復(fù)。放于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后觀測抑菌帶有無及大小，判斷菌株是否具有抑菌作用。

（2）拮抗細(xì)菌復(fù)篩。初篩獲得的內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)活化后接入5 mL NB培養(yǎng)基的10 mL離心管中，室溫，160 r/min的條件下?lián)u培3 d。于12 000 r/min室溫離心20 min，使用注射器取上清液，再用0.22 μm的細(xì)菌過濾器過濾上清液至無菌10 mL離心管中得到無菌發(fā)酵液液，用移液槍取其中1 mL的無菌發(fā)酵液加入至25 mL 50 ℃的PDA培養(yǎng)基混勻后倒平板，放入油茶炭疽病菌菌餅至28 ℃培養(yǎng)，3 d后觀察并測定菌落大小并計算抑制率，篩選出強(qiáng)拮抗菌株。

抑菌率=（對照-處理）/對照×100% （1）

2.3 拮抗菌株的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定

參照《Bergey’s manual of determinative bacteriology》[6]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]。并依據(jù)菌落特性、形態(tài)和菌體的生理生化反應(yīng)等進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：利用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒提取菌株DNA，使用通用引物27F“5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′”和1492R“5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′”進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 μL PCR擴(kuò)增體系：引物27F和1492R各1 μL，2×PCR Master mix 7 μL，內(nèi)生細(xì)菌的DNA模板1 μL，雙蒸水10 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min，（95 ℃ 45 s、55 ℃ 50 s、72 ℃ 40 s）（30個循環(huán)），72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫相關(guān)序列進(jìn)行BLAST比對并下載高同源性的相似序列，采用Mega 7.0軟件構(gòu)建內(nèi)生細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹并確定其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

3 結(jié)果與分析

3.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離及拮抗菌株的篩選

將NA培養(yǎng)基上分離出來的細(xì)菌進(jìn)行純化、保存，共獲到125株內(nèi)生細(xì)菌，菌株編號為Y1~Y125。通過平板對峙法，共有23株對油茶炭疽病菌具有拮抗作用的菌株，占菌株總數(shù)的17.6%（圖1）。

圖1 部分內(nèi)生細(xì)菌對油茶炭疽病菌的抑菌效果

參照周國英等[8]方法將抑菌帶寬度大小將拮抗菌分為強(qiáng)（7~10 mm）、中（4~7 mm）和弱（＜4 mm）等3類。抑菌帶寬度小于4 mm的有9株，占拮抗菌株的39.1%；抑菌帶寬度為4～7 mm的有8株，占拮抗菌株的34.8%；抑菌帶寬度為4~7 mm的有6株，占拮抗菌株的26.1%。

將平板對峙法初篩獲得的6株強(qiáng)拮抗菌的發(fā)酵液進(jìn)行復(fù)篩，6株拮抗菌的發(fā)酵濾液對油茶炭疽病菌具有明顯的抑制作用，其中菌株Y55的抑菌率最低（66.0%），菌株Y56（79.3%）、Y57（74.4%）、Y76（78.2%）、Y112（79.1%），而菌株Y77的抑菌率最高（82.4%）。

3.2 強(qiáng)拮抗細(xì)菌菌株的鑒定

3.2.1 形態(tài)特征及生理生化反應(yīng)結(jié)果 在NA培養(yǎng)基上，菌株Y55、Y57的菌落均呈白色，圓形或近似圓形；菌株Y112的菌落呈米黃色，不透明、不光滑；菌株Y56的菌落呈淡黃色，圓形，表面光滑；菌株Y76的菌落為灰色，不規(guī)則圓形，不透明；菌株Y77菌落為淡黃色，半透明。光學(xué)顯微鏡下觀察到菌株Y55、Y56、Y57、Y76、Y112均呈桿狀，革蘭氏染色陽性，產(chǎn)芽孢；菌株Y77呈規(guī)格細(xì)胞圓球狀，革蘭氏染色陽性，可產(chǎn)芽孢。

6株拮抗內(nèi)生細(xì)菌生理生化特性如表1所示。根據(jù)菌株的形態(tài)特征和生理生化特性，初步鑒定菌株Y55、Y57、Y112為芽孢桿菌屬（），菌株Y56、Y76、Y77為梭形芽孢桿菌屬（）。

表1 6個菌株生理生化反應(yīng)結(jié)果

“+”表示反應(yīng)呈陽性；“-”表示反應(yīng)呈陰性

3.2.2 16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析 從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)屬及種的16S rDNA基因序列，以16S rDNA基因序列為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，Y55、Y57與位于同一分支，其聚類支持強(qiáng)度為100%；Y56與位于同一分支；Y77與位于同一分支，其聚類支持強(qiáng)度為100%。綜合形態(tài)特征、生理生化和16S rDNA序列分析將Y55和Y57鑒定為，Y56鑒定為，Y76鑒定為sp.，Y77鑒定為，Y112鑒定為sp.。

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建油茶拮抗內(nèi)生細(xì)菌及其它相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生細(xì)菌是植物中重要的有益微生物，利用內(nèi)生細(xì)菌協(xié)助宿主植物抵制病原菌侵染是當(dāng)前植物病害生物防治的重要途徑[9-13]。大量研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌具有一菌多防的效果。周國英等[8]從油茶中分離篩選獲得對油茶炭疽病病菌的生長有較強(qiáng)抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌Y13，抑菌直徑達(dá)10 mm以上；曲田麗等[14]從合歡葉中分離的內(nèi)生菌H8對6種植物病原菌均有抑制作用；Gong等[15]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌代謝產(chǎn)物中有能抑制植物病原菌的抗菌脂肽；蘇博等[16]從健康杜仲篩選出拮抗菌株DZSY21可引起病原菌菌絲斷裂、畸形等，同時對玉米根系分泌物具有較好的趨化性。本研究從健康油茶中分離篩選獲得23株對油茶炭疽病病菌具有抑制的內(nèi)生細(xì)菌，表明油茶中存在豐富的拮抗微生物資源。其中6株內(nèi)生細(xì)菌對油茶炭疽病病菌的生長具有較強(qiáng)的抑制作用，同時6株菌株的發(fā)酵濾液對毛竹枯梢病病菌的生長也具有明顯的抑制作用，抑菌率為67%~82%。

對6株拮抗內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，3株內(nèi)生細(xì)菌為芽孢桿菌屬，2株為梭形芽孢桿菌屬，這與周國英等[8]的研究結(jié)果是一致的。芽孢桿菌能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，有利于其在環(huán)境中定殖、繁殖及開發(fā)成生防菌劑，Jeong et al.[17]研究發(fā)現(xiàn)，從腌制的泰國食物中分離得到的西姆芽胞桿菌可以抵抗病原物并促進(jìn)植物生長；張愛梅等[18]從沙棘根瘤內(nèi)生細(xì)菌中篩選出一株具有廣譜抑菌作用的內(nèi)生細(xì)菌TT201，經(jīng)鑒定為側(cè)孢短芽孢桿菌。隨著油茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和環(huán)境保護(hù)的意識增強(qiáng)，替代或部分替代化學(xué)藥劑是未來趨勢，因此，應(yīng)用植物內(nèi)生細(xì)菌防治油茶炭疽病具有廣闊前景。由于植物內(nèi)生細(xì)菌所處的生境特殊，有關(guān)于拮抗內(nèi)生細(xì)菌在油茶的定殖能力、菌株抑菌物質(zhì)性質(zhì)及林間的施用劑量等仍需進(jìn)一步深入研究。

[1] 何方, 何柏, 李忠海, 等. 茶油產(chǎn)品品質(zhì)等級標(biāo)準(zhǔn)制訂說明[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究, 2004, 22(4): 105-108.

[2] 張日清, 呂芳德, 王義強(qiáng), 等. 我國油茶生產(chǎn)現(xiàn)狀、存在問題及發(fā)展意義[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究, 1996, 45(2): 203-205.

[3] 徐學(xué)兵. 茶油研究進(jìn)展評述[J]. 中國油脂, 1995, 20(5): 7-9.

[4] 彭邵鋒, 王湘南, 陳永忠, 等. 油茶及其近緣種種質(zhì)資源收集與保存利用[J]. 湖南林業(yè)科技, 2007, 34(2): 16-18.

[5] 周國英, 宋光桃, 李河. 油茶病蟲害防治現(xiàn)狀及應(yīng)對措施[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報, 2007,27(6): 179-182.

[6] 布坎南 R E. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1984.

[7] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001.

[8] 周國英, 盧麗俐, 劉君昂, 等. 油茶炭疽病拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2008, 34(6): 698-700.

[9] 廖曉蘭, 羅寬. 油菜花上細(xì)菌的分離及其對菌核菌的拮抗作用[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2000, 26(4): 296-298.

[10] 易圖永, 高必達(dá), 何昆, 等. 水稻紋枯病菌生防細(xì)菌的篩選[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2000, 26(2): 116-118.

[11] 周燕, 成志軍, 易有金, 等. 曬黃煙內(nèi)生菌株篩選及對青枯病生物防治[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2005, 31(5): 500-501.

[12] 馬超, 朱洪磊, 黃太偉, 等. 番茄灰霉病菌內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選及鑒定[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 46(3): 437-440, 452.

[13] 張洪波, 巢進(jìn), 王躍強(qiáng), 等. 柑橘潰瘍病拮抗菌的分離篩選及其田間防效[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2007, 33(5): 605-607.

[14] 曲田麗, 張淑穎, 金玉蘭. 合歡內(nèi)生菌H8的分離、鑒定及其抗菌代謝物質(zhì)研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報, 2015, 30(1): 54-60.

[15] Gond S K, Bergen M S, Torres M S, et al. Endophyticspp. produce antifungal lip peptides and induce host defence gene expression in maize[J]. Microbiological Research, 2015, 172(1): 79-87.

[16] 蘇博, 姚沛琳, 劉小陽, 等. 杜仲內(nèi)生細(xì)菌對植物病原菌的拮抗作用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2018, 45(6): 148-154.

[17] Jeong H Y, Jeong D E, Kim S H, et al. Draft genome sequence of the plant growth-promoting bacteriumKCTC 13613T[J]. Journal of Bacteriology, 2012, 194(15): 4148-4149.

[18] 張愛梅, 吳菊艷, 韓雪英, 等. 沙棘根瘤內(nèi)生細(xì)菌中抑菌促生菌株的篩選和鑒定[J]. 微生物學(xué)通報, 2019, 46(5): 74-84.

Screening and Identification of Beneficial Endophytic Bacteria to Controland Effects of Control Diseases

ZHANG Lin-ping1, ZHANG Yi-ping2, CHNE Jing1, GAO Yi-xin2, CHEN Yan-liu1, WU Fei1, GUO Chun-lan1

（1. Key Laboratory of State Forestry Administration on Forest Ecosystem Protection and Restoration of Poyang Lake Watershed, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2. Forestry Bureau of Guixi City, Guixi, Jiangxi 335400, China）

125 bacteria strains were obtained fromleaves which were collected from Jiangxi province. The antagonistic screening of endophytes was carried out that 25 strains can inhibit mycelium ofgrowth markedly; and six of them was strongly antagonistic tothrough fermentation. The strain Y55, Y77 as, Y56 as, Y76 assp., Y77 asand Y112 assp., which identified by morphological observation, physiological, biochemical determination and 16S r DNA sequence analysis.

; antagonistic endophytic bacteria;; biological control

S794.4

A

2095-3704（2020）01-0014-05

2020-02-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31660189）和江西省教育廳項(xiàng)目（GJJ150414）

張林平（1979—），副教授，博士，主要從事森林保護(hù)學(xué)研究，zlping619@163.com。

張林平, 張儀平, 陳靜, 等. 油茶炭疽病拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選及鑒定[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2020, 43(1): 14-18.

10.3969/j.issn.2095-3704.2020.01.03