枯草芽孢桿菌產堿性果膠酶發酵條件的優化

王克芬,佟新偉,張 杰,王興吉,劉文龍

(山東隆科特酶制劑有限公司,山東省酶制劑發酵技術重點實驗室,山東 臨沂 276400)

果膠酶是能分解植物組織中果膠質的酶類物質,廣泛分布于微生物和高等植物中,在一些昆蟲和原生動物體內也有發現[1-3]。1972年,研究者首次從噬堿菌中分離出堿性果膠酶。據報道，由微生物生產的果膠酶占全球食品用酶的25%,已成為一種十分重要的生物酶制劑[4-6]。果膠酶主要包括原果膠酶、果膠醋酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶等四大類[7-10]。來源于微生物的原果膠酶、果膠醋酶、聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶的最適pH有偏酸的、偏堿的,而果膠酸裂解酶則全部屬于堿性果膠酶[11-14]。真菌來源的果膠酶較細菌來源的偏酸[15-16]。堿性果膠酶的作用原理是通過反式消去作用切斷植物纖維上果膠酸及果膠酸酯分子中的α-1,4-糖苷鍵[17]。

果膠酶的生產菌株有很多,應用較多的是真菌,以曲霉屬菌較為常見。真菌產的果膠酶大部分是酸性果膠酶,這類真菌主要是曲霉屬、青霉屬、鐮孢屬、毛霉屬、酵母屬。細菌產的果膠酶以堿性果膠酶為主,這類細菌主要是假單抱菌屬、黃單孢菌屬、歐文氏菌屬、芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌等[18]。

酸性果膠酶主要應用于果汁和蔬菜產業、釀酒業,堿性果膠酶在麻類的生物脫膠、棉織物的精練、造紙、動物飼料、果膠廢水預處理、咖啡發酵和茶發酵等領域應用廣泛[19-20]。堿性果膠酶在紡織行業中有廣泛的應用前景,主要用于苧麻脫膠和棉織物前處理的精煉環節中,與高溫堿煮方法相比,具有保護纖維、降低能耗、沒有化學污染等優勢[21-22]。

產堿性果膠酶的菌株的培養基由碳源、氮源、無機鹽等組成。本實驗采用枯草芽孢桿菌產堿性果膠酶,對其發酵培養基及培養條件進行優化,旨在提高該菌株的發酵水平,降低生產成本,為后續實驗及擴大生產提供幫助。

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌: 實驗室篩選出保存的菌種。

1.2 培養基

平板培養基:蛋白胨11 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉11 g/L、瓊脂18 g/L、pH為7.0。

搖瓶種子培養基:蛋白胨11 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉11 g/L、pH為7.0。

種子罐培養基:蛋白胨11 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉11 g/L、pH為7.0。

發酵罐培養基:35 g/L棉籽蛋白、30 g/L麥芽糖漿、20 g/L果膠、pH為7.0。

1.3 培養方法

1.3.1 種子的活化

將凍存種子在平板培養基上畫線分離,在36 ℃條件下培養36 h,選取活化好的單菌落于裝在200 mL搖瓶中的種子培養基上,在36 ℃、220 r/min條件下培養12 h。

1.3.2 種子罐的培養

以5%的接種量轉接到10 L種子罐培養基中,在36 ℃、罐壓0.05 MPa條件下,通過增加轉速和風量控制溶氧50%以上,補氨控制PH7.0,培養11 h。

1.3.3 發酵罐的培養

以5%的接種量接到含30L培養基的發酵罐中,在36 ℃、罐壓0.05 MPa條件下,通過增加轉速和風量控制溶氧30%40%,補氨控制PH7.0,培養52 h。

1.4 堿性果膠酶活力測定

將發酵液在4 ℃條件下,在12 000 r/min的高速冷凍離心機上離心5 min,取上清液制成酶液測定酶活力。方法如下。

取1 mL酶液和2 mL果膠1%(w/v)果膠(PH9.0緩沖液配制)溶液分別置于兩個試管中,于45 ℃水浴預熱5 min,再將它們充分混合,準確反應10 min,取上述混合物1 mL加入9 mL 0.01 mol/L HCL終止反應,在235 nm處測定吸光值,以滅過酶活的酶液作為空白對照。

將1個標準酶活力單位定義為每分鐘裂解果膠產生1 umol不飽和聚半乳糖酸酸的酶量。不飽和聚半乳糖酸酸在235 nm處的摩爾吸光系數為4 600 mol/(L·cm)。

酶活力:U=(A/4600)×106×10-3×3×10×10-1×n=A×n×30/46

上式中，U為酶液的酶活力,單位為U/mL;A為OD235;n為酶液稀釋倍數。

1.5 總糖測定

標準曲線的制作過程如下:取6支25 mL刻度試管,編號后按順序分別加入0、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的100 μg/mL蔗糖標準液,再分別加入2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL的水。接著按順序加入1 mL 9%的苯酚溶液,搖勻。最后加入濃硫酸5 mL,混均后靜置冷卻,以試劑空白液為對照,用分光光度計在485 nm波長處,1 cm比色皿測定吸光度值。

以蔗糖濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線。如圖1所示。

圖1 總糖測定標準曲線

樣品總糖測定過程如下:取一定稀釋倍數(稀釋100或200倍)的樣品液2 mL,步驟與制作標準曲線的相同,按順序分別加入苯酚、濃硫酸溶液,顯色并測定光密度。用標準線性方程求出總糖的量。

2 結果與分析

2.1 培養基配方優化

利用20 L發酵罐，對枯草芽孢桿菌液態發酵產堿性果膠酶培養基中的發酵主料種類及配比進行優化研究。

2.1.1 不同碳源對發酵產酶的影響

將發酵培養基中的30 g/L麥芽糖漿分別用30 g/L的乳糖、蔗糖、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉替換。測定發酵液上清堿性果膠酶酶活，結果如表1所示。

表1 碳源對產酶的影響

碳源種類對產酶的影響較大,其中馬鈴薯淀粉的產酶效果最好,其次是玉米淀粉、麥芽糖漿、蔗糖、乳糖。馬鈴薯淀粉促進菌體產生較高酶活,原因可能是馬鈴薯淀粉含有多種本菌株所需要的營養成分,促進了堿性果膠酶的生成。因此,選擇馬鈴薯淀粉作為培養基碳源。

以馬鈴薯淀粉為作為優化培養基的碳源,對不同濃度的馬鈴薯淀粉進行實驗。將馬鈴薯淀粉質量濃度按梯度設為20、25、30、35、40、45 g/L,其他成分不變,結果如表2所示。

表2 馬鈴薯淀粉濃度對產酶的影響

馬鈴薯淀粉濃度為35 g/L時相對酶活最高。馬鈴薯淀粉濃度對產酶有很大影響:若濃度過低則導致不能滿足菌體代謝需求,進而影響產酶;濃度過高則提高發酵液的滲透壓,就會使細胞脫水,導致細胞受損或死亡,形成代謝阻遏,抑制酶的表達。選擇濃度為35 g/L的馬鈴薯淀粉進行氮源優化實驗。

2.1.2 不同氮源對產酶的影響

將發酵培養基中的35 g/L棉籽蛋白分別用35 g/L硝酸鈉、硫酸銨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、玉米漿、豆餅粉替換。結果如表3所示。

表3 氮源對產酶的影響

無機氮源與有機氮源對酶表達影響的區別很大。無機氮源不但未促進產酶反而降低酶活水平,有機氮源對酶的影響較大,在使用豆餅粉時能促進產酶。對不同質量濃度的豆餅粉進行實驗,以酶活的百分比表示酶活的含量,最大酶活為100%,結果如表4所示。

表4 豆餅粉濃度對產酶的影響

豆餅粉的濃度為30 g/L,其相對酶活高于其他質量濃度,表明此濃度利于產酶,因此選取30 g/L豆餅粉作為發酵培養基的氮源。

2.1.3 無機鹽對產酶的影響

在優化碳氮源的基礎上添加無機鹽，研究微生物對產酶的影響,分別添加20 mmol/L的ZnSO4、MgSO4、CaCl2、NaCl、FeSO4于優化培養基中,結果如表5所示。

表5 金屬離子對產酶的影響

從表中可以看到對酶的表達影響最大的是CaCl2，其次是ZnSO4。這兩種鹽的促進作用較一致,因此在培養基中都添加相同的摩爾比例,考察這兩種鹽對酶表達的影響,結果如表6所示。

表6 不同濃度Ca2+和Zn2+對產酶的影響

實驗結果表明，25 mmol/L的Ca2+和Zn2+對酶活的影響較大,均高于對照組,這表明添加Ca2+或Zn2+對酶的表達有一定的促進作用,因此添加25 mmol/L(即4.025 g/L)的ZnSO4和2.775 g/L的CaCl2于優化培養基中進行下一步實驗。

2.1.4 磷酸鹽對產酶的影響

磷是菌體生長繁殖所需的重要元素,在發酵培養基中的磷酸鹽對pH值起到緩沖作用,避免pH值短時間內迅速改變,在上述優化配方的基礎上添加0.6 mol/L磷酸鹽對產酶的影響,結果如表7所示。

表7 磷酸鹽對產酶的影響

由表7可以看出,添加Na2HPO4可以有效提高酶活,并且可以促進菌體的生長。進一步對不同濃度的Na2HPO4進行實驗,以酶活的百分比來表示酶活的含量,最大酶活為100%,結果如表8所示。

表8 磷酸鹽對產酶的影響

實驗結果表明,濃度為0.8 mol/L(即113.6 g/L)的Na2HPO4可以進一步提高酶活水平。在優化配方后,進一步對發酵過程的控制方法進行優化。

2.2 培養條件優化

2.2.1 溫度對產酶的影響

溫度在發酵過程中起著非常關鍵的作用,影響著微生物的整個代謝過程。分別設置34、35、36、37、38 ℃進行實驗,結果如表9所示。

表9 培養溫度對產酶的影響

從表9可知,溫度在35 ℃時酶活最大,溫度低于35 ℃時酶活較低,而高于35 ℃時酶活梯度下降。當溫度過低時菌體代謝較慢,所產酶量也較少；當溫度過高時菌體代謝所需酶的活性降低，導致發酵減緩,從而影響酶的表達。

2.2.2 接種量對產酶的影響

接種量不同也會影響菌體代謝。分別設定1%、3%、5%、7%、9%的接種量,測定酶活，比較產酶效果,結果如表10所示。

表10 接種量對酶活的影響

從表中可知,接種量為3%對酶活的影響較大。接種量的大小影響發酵過程酶的表達：接種量小導致菌體生長緩慢降低酶的發酵水平；接種量較大，前期菌體生長迅速,營養物質迅速消耗,并產生大量代謝廢物及有毒物質,抑制中后期微生物生長。因此,選取接種量為3%。

2.2.3 發酵過程pH優化

pH對菌體發酵培養及酶的表達有至關重要的影響。通過補加磷酸和氨水來控制發酵過程中的pH,測定發酵過程中的酶活水平,結果如表11所示。

表11 發酵罐中不同pH對酶活的影響

當pH=7.4時對產酶更有利。因此在后續的補料過程中控制pH=7.4進行實驗。

2.2.4 發酵罐補料優化

碳源在菌體發酵過程中起著至關重要的作用。不斷補充碳源可以為菌體的生長和產酶提供能量,以延長產酶周期。因此，實驗在發酵罐培養過程中不斷流加350 g/L濃度的不同碳源,以維持發酵液中的總糖濃度為20 μg/mL,實驗結果如表12所示。

表12 補料對產酶的影響

實驗表明，流加350 g/L濃度的葡萄糖對菌體產酶有非常明顯的促進作用。

2.2.5 發酵罐補料配方的優化

果膠物質在菌體發酵過程中起著產酶促進劑的作用,不斷補充碳源可以為菌體的生長和產酶提供能量。隨著酶活水平不斷提高,果膠物質大量消耗,會導致此類誘導物質的含量不足,因此在補料配方中添加不同濃度的果膠以觀察其對酶活的影響,實驗結果如表13所示。

實驗表明,補料配方中添加10 g/L的果膠會誘導菌體產生更多的堿性果膠酶,達到更高的酶活水平。使用以上優化的配方及控制工藝后,發酵罐的產酶曲線與之前的產酶曲線如圖2所示。

表13 補料對產酶的影響

圖2 發酵前后的產酶曲線

3 結論

對本公司所儲藏的枯草芽孢桿菌進行液體發酵產堿性果膠酶的優化實驗,最終確定了枯草芽孢桿菌的最優產酶培養基:馬鈴薯淀粉35 g/L、豆餅粉30 g/L、氯化鈣2.775 g/L、硫酸鋅4.025 g/L、Na2HPO4113.6 g/L、果膠20 g/L。最優發酵控制工藝:發酵溫度為35 ℃,接種量為3%。在發酵過程中控制PH值為7.4,維持罐壓0.05 MPa以提高供氧能力,通過調整轉速和風量,使發酵罐中的溶氧水平維持在30%～40%。為進一步提高酶活水平,采用連續補料的方式,優化后的補料培養基配方為:葡萄糖350 g/L、果膠10 g/L。通過補料控制總糖濃度為20 μg/mL,發酵產酶周期為52 h左右。經過上述優化后,最終酶活達到6120 U/mL,較初始配方的酶活1061 U/mL提高了4.77倍。

本實驗存在很多不足。例如,在補料過程中僅補加單一的碳源,營養成分較單一,產酶量相對較低。在后續實驗中將考慮配合添加部分氮源或磷酸鹽等,以進一步提高酶的產量。利用枯草芽孢桿菌產堿性果膠酶,具有發酵周期短、安全性好、酶活高等優點,對本出發菌株進行物理和化學誘變處理,能夠進一步提高酶活。