電針干預對尾部懸吊小鼠比目魚肌Foxo3a蛋白及mRNA表達的影響

季傳婷，虎力，梁永瑛，溫佩彤，徐平

(1.上海市徐匯區(qū)漕河涇街道社區(qū)衛(wèi)生服務中心，上海 200235；2.上海中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,上海 201203；3.上海市光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200052)

失重條件下，人或動物的骨骼肌特別是抗重力肌會出現(xiàn)明顯的萎縮，嚴重影響正常的功能活動。其發(fā)病機制復雜，肌肉發(fā)生的一系列變化特別是分子機制的變化目前還在不斷探索中，F(xiàn)oxo3a(Forkhead Box O3a)屬叉頭轉(zhuǎn)錄因子的O亞型，是 Foxo亞家族的成員之一[1]。廣泛表達于各種組織器官，如骨骼肌、心、腦、胰腺、肺、肝、腎、脾、小腸、外周血白細胞等[2-3]，有抑制細胞增殖的作用。鑒于電針在臨床上對于多種原因?qū)е碌墓趋兰∥s的有效性和本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針干預能夠影響尾部懸吊小鼠形態(tài)學等改變[4]，因此本研究仍以電針為干預措施，對尾部懸吊小鼠比目魚肌的Foxo3a進行檢測，從而探討Foxo3a在電針干預失重性骨骼肌萎縮中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組

健康雄性C57小鼠，SPF清潔級，共28只，體質(zhì)量18～22 g，購于斯萊克實驗動物公司(上海)，動物合格證號：SCXK(滬)2007-0005，動物的飼養(yǎng)和實驗在上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心進行。整個實驗過程中對動物的各種處理均按照科技部2006年的關(guān)于動物的使用及倫理學規(guī)定進行。將動物隨機分為正常組、尾吊組、提前電針組和電針組，每組7只。

1.1.2 主要儀器與試劑

Varifuge 3.0RS高速離心機(德國Heracus)；MK3酶標儀(芬蘭Labsystems Multiskan)；PS-9電轉(zhuǎn)儀(大連競邁科技有限公司)；mini protean 3 cell電泳儀(BIO-RAD公司)； Foxo3a(美國CST公司)；cDNA合成試劑盒。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型的建立

用醫(yī)用膠帶固定距離動物尾尖部約2～3 cm處,固定處連接鐵鏈，鐵鏈懸吊于單籠頂部，調(diào)整鐵鏈高度使小鼠前肢著地，并可自由活動，但不能夠及垂直的四壁(單籠體積45 cm×40 cm×30 cm)而后肢懸空，身體的長軸與籠底平面呈30°～35°角(參照陳杰等[5]改良式大鼠尾部懸吊法建立)。

1.2.2 分組干預

正常組全程常規(guī)飼養(yǎng)；尾吊組前14 d常規(guī)飼養(yǎng)，后14 d尾部懸吊造模；提前電針組在尾吊組處理基礎(chǔ)上于前14 d加用每天電針；電針組在尾吊組基礎(chǔ)上于后14 d加入每天電針干預。電針每日1次，每次15 min。

電針方法：自制與水平面呈30°角的平臺，固定小鼠于平臺上，頭部在下、下肢在上。參照《實驗針灸學》[6]穴位定位，選取小鼠雙側(cè)“足三里”“陽陵泉”進行針刺。選用0.25 mm×25 mm啟舟牌針灸針，直刺，進針深度約3～4 mm，接電針(SDZ-Ⅱ型蘇州醫(yī)療用品廠電子針療儀)，負極接 “足三里”穴，正極接同側(cè)的“陽陵泉”穴，電流1 mA，連續(xù)波，頻率為20～30 Hz，強度以小鼠的四肢輕微抖動為度。每日電針1次，每次為15 min，連續(xù)治療14 d。

1.3 觀察指標與檢測方法

結(jié)束實驗后，各組小鼠脫頸處死,快速取左側(cè)比目魚肌,立即置于-80 ℃液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 Western blot法檢測Foxo3a

將液氮保存的比目魚肌取出，加蛋白裂解液后碾磨,并用離心機離心,取上清后調(diào)至統(tǒng)一濃度，高溫下變性4 min后用12%PAGE電泳；轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上(半干轉(zhuǎn)1 h 30 min)； PBS洗膜,滴加一抗(Foxo3a 1∶1 000；β-actin 1∶10 000)，4 ℃下2 h；加兔二抗，加入發(fā)光劑后曝光顯影。結(jié)果應用Quantity One軟件分析。設(shè)β-actin作為內(nèi)參。

1.3.2 Foxo3a的Real-time PCR檢測

取部分液氮保存比目魚肌，提取總RNA，取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；以SYBR Green作熒光染料，5 min 95℃預變性、15 s 95℃變性、60℃持續(xù)45 s退火及延伸，上述過程循環(huán)40次，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行Foxo3a、β-actin PCR擴增。以β-actin為內(nèi)參對照，以系統(tǒng)自帶的ABI Prism 7500 SDS軟件進行結(jié)果分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠Foxo3a蛋白表達

尾吊組與正常組比較Foxo3a蛋白的表達增加(P<0.05)；電針組與提前電針組及尾吊組相比Foxo3a蛋白表達減少(P<0.05)，但較正常組仍高(P<0.05)；電針組與提前電針組之間差異不明顯。見圖1、圖2和表2。

注：1電針組；2尾吊組；3正常組；4提前電針組圖1 各組小鼠Foxo3a蛋白表達條帶

注：與正常組比較，*P#P圖2 各組小鼠Foxo3a蛋白表達比較

表2 各組小鼠比目魚肌Foxo3a蛋白表達比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與尾吊組比較，#P<0.05。

2.2 各組小鼠Foxo3a mRNA表達

尾吊組與正常組Foxo3a mRNA比較明顯增高(P<0.05)；，電針組和提前電針組與尾吊組相比Foxo3a mRNA明顯降低(P<0.05)，但較正常組仍高(P<0.05)；電針組與提前電針組之間差異不明顯。見圖3、表3。

注：與正常組比較，*P#P圖3 各組小鼠比目魚肌Foxo3a mRNA表達比較

表3 各組小鼠比目魚肌Foxo3a mRNA表達比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與尾吊組比較，#P<0.05。

3 討論

針灸在治療多種骨骼肌萎縮中具有很好療效，如李敏等針灸治療經(jīng)肌電圖證實坐骨神經(jīng)損傷性麻痹性肌萎縮等療效顯著，能有效延緩肌肉萎縮，促進神經(jīng)再生等[7-9]，本研究在前人研究和本課題前期發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上，繼續(xù)以電針對尾部懸吊的模擬失重小鼠模型進行了干預。

選穴方面，《黃帝內(nèi)經(jīng)》載“陽明者，五臟六腑之海，主潤宗筋，宗筋主束骨而利關(guān)節(jié)也。沖脈者，經(jīng)脈之海也，主滲灌溪谷，與陽明合于宗筋，陽明總宗筋之會，會于氣街，而陽明之長，皆屬于帶脈而絡(luò)于督脈，故陽明虛。則宗筋縱，帶脈不引，故足痿不用也”。而足三里為足陽明胃經(jīng)之合穴，“合治內(nèi)腑”，因此筆者選穴足三里。陽陵泉為足少陽膽經(jīng)之合穴，《難經(jīng)》云：“筋病治此”,為八會穴之“筋會”，是治療筋病的要穴。《馬丹陽天星十二穴治雜病歌》中載：“陽陵居膝下，外廉一寸中，膝腫并麻木，冷痹及偏風……舉足不能起，坐臥似衰翁，刺入六分止，神功妙不同。”因此筆者同時選用陽陵泉穴。

Foxo是轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與調(diào)節(jié)多種細胞進程，其中包括細胞周期、細胞凋亡、應激反應以及代謝等。在人類中有4個Foxo的同源基因，分別是Foxo1，F(xiàn)oxo2，F(xiàn)oxo3和Foxo4。其中Foxo3a在許多類型的細胞中有抑制細胞增殖的作用，可促進肌肉萎縮的表達[10-12]。通過Western blot和Real-time PCR檢測顯示，F(xiàn)oxo3a在4組小鼠中的蛋白和分子水平的表達一致。其中在正常組表達較低，而在尾吊組表達增高，F(xiàn)oxo3a在骨骼肌萎縮尾吊組較正常組的高表達，提示了Foxo3a在骨骼肌萎縮中的抑制細胞增殖、促進萎縮的作用和造模的成功；同步電針和預防電針治療降低了Foxo3a的表達，說明電針干預能夠降低Foxo3a的表達，電針發(fā)揮了對抗Foxo3a促細胞萎縮的作用。然而電針組和提前電針組的Foxo3a表達仍高于正常組，經(jīng)電針治療后Foxo3a的表達仍未降到正常組的水平，思考其原因:一是治療14 d的治療時間不夠，有待于更長時間的治療周期的進一步觀察;二是可能電針并不能完全對抗Foxo3a，或有待于加入中藥或其他治療方法和手段或可發(fā)揮更好作用，這有待于在以后的工作中觀察。電針組和提前電針組的Foxo3a表達未顯示明顯差異。提示兩種不同切入干預時機的選擇可能與對抗骨骼萎縮分子指標的影響不大，也可能與筆者選擇的觀察點只有14 d，觀察點少和觀察時間較短有關(guān)，這都有待增加觀察點和延長觀察時間進一步研究。另外骨骼肌萎縮中Foxo3a的上下游分子還有多種，也有待于筆者進一步的研究。

鑒于多種骨骼肌萎縮的相似臨床表現(xiàn)和針灸干預的有效性，本研究對其他類型的肌萎縮可提供一定的借鑒，筆者也期望在未來工作中繼續(xù)研究有所發(fā)現(xiàn)。