多壁碳納米管和重金屬鎘的細菌毒性及影響機制

付 勇，裴建川，李 梅，王鵬程，王潔潔

（浙江農林大學 環境與資源學院，浙江 杭州 311300）

隨著納米技術的快速發展，碳納米管在材料、催化、光學器件、分子開關、生物醫學、環境修復等各領域都有了廣泛的研究和應用[1]，同時碳納米管對人類健康和生態環境的潛在風險也引起了世界范圍內的廣泛關注[2-6]。進入環境中的碳納米管將不可避免地與其他化學物質共存，碳納米管對共存污染物毒性的影響及復合毒性也越來越多地受到了研究者的關注。碳納米管可以通過吸附共存污染物，降低或增強共存污染物對生物的毒性。如劉信勇等[7]發現實驗用多壁碳納米管本身對斑馬魚Danio rerio沒有毒性，但卻由于吸附了鉛（Pb）和鋅（Zn），導致重金屬在斑馬魚體內的積累，毒性劇增。YU等[8]發現表面未處理的單壁和多壁碳納米管抑制了大型蚤Daphnia magna對重金屬的吸收，但由于單壁和多壁碳納米管表面富有含氧官能團，能吸附大量重金屬，因此大型蚤內重金屬積累增強。WANG等[9]發現銅（Cu）和鉻（Cr）增強了碳納米管對微生物種群的影響，以羧基化和羥基化碳納米管毒性更強。碳納米管與重金屬的復合毒性是協同、疊加還是拮抗，不僅取決于碳納米管和重金屬的相互作用，還取決兩者與生物體的相互作用。具有不同表面官能團的多壁碳納米管性質差異較大，影響其與重金屬和生物體的相互作用，從而影響復合毒性；開展不同官能團多壁碳納米管對重金屬的吸附及生物效應的研究十分必要。細菌是單細胞原核微生物，結構簡單，與其他生物相比，對污染物的毒性更敏感。大腸埃希菌Escherichia coli在自然界中普遍存在，常被用作毒性實驗模型微生物；重金屬鎘（Cd）毒性較大，在污染水體中常見。因此，本研究以大腸埃希菌為模型細菌，研究3種多壁碳納米管（短、短羥基和短羧基多壁碳納米管）和Cd的復合細菌毒性，從多壁碳納米管、重金屬、細菌相互作用的角度闡述了復合毒性機制，試圖為水體中多壁碳納米管和重金屬的復合毒性效應評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

短多壁碳納米管（無基團、羧基和羥基）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。具體參數為：純度＞95%，內徑為5.0～10.0 nm，外徑為8.0～15.0 nm，長度為0.5～2.0 μm。稱量相應的多壁碳納米管顆粒，用超純水進行配制，使用前超聲20 min。稱取 0.274 4 g Cd（NO3）2·4H2O，用超純水溶解并定容至1 000 mL，配制成100 mg·L-1的Cd2+儲備液。所用化學物質均購買自上海國藥集團。

實驗室大腸埃希菌（登錄號:MG388227）為從生活污水中篩選分離得到[10]。菌種接種于LB固體平板，保存于4℃冰箱中。使用前接種于LB液體培養基（pH 7.0）培養過夜，為避免生理鹽水中鹽度對實驗的影響，細菌懸液用超純水洗滌2次后懸浮于超純水中，調節吸光度D（600）至1.0備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 毒性實驗 調節多壁碳納米管至0、20、50、100、200 mg·L-1，調節Cd2+至0、1、2、4、8、10 mg·L-1，分別測定對大腸埃希菌的單獨毒性，作為混合物細菌毒性的對照組；并比較該復合細菌毒性（即聯合或混合毒性）和疊加毒性（單獨毒性的疊加），判斷復合細菌毒性性質（加和、協同或拮抗）。為進一步明確多壁碳納米管對低濃度Cd2+細菌毒性的影響，固定Cd2+質量濃度（1 mg·L-1），由于多壁碳納米管質量濃度過高，團聚現象嚴重，質量濃度過低則與重金屬相互作用不明顯，因此固定多壁碳納米管質量濃度為 100 mg·L-1， 與不同質量濃度（0、 1、 2、 4、 8、 10 mg·L-1）Cd2+混合， 測定多壁碳納米管-Cd2+混合物的細菌毒性； 固定 Cd2+質量濃度（1 mg·L-1）， 與不同質量濃度（10、 20、 50、 100、 200 mg·L-1）多壁碳納米管混合，測定Cd2+-多壁碳納米管混合物的細菌毒性。毒性實驗分為3 h毒性暴露實驗和細菌生長抑制實驗，均在恒溫搖床中進行，具體方法參照文獻[10]。細菌存活率（SB）按以下公式計算：SB=（Dst-Dso）/（Dct-Dco）×100%。其中，Dst和Dso分別代表樣品在t時刻和初始時刻的吸光度，Dct和Dco分別代表相應對照組在t時刻和初始時刻的吸光度。根據每次實驗對照組遲滯期長短，本研究t取2或3 h（對數生長期初期）。

1.2.2 多壁碳納米管zeta電位測定 多壁碳納米管的團聚狀態與大腸埃希菌的相互作用均與多壁碳納米管的表面電荷有關。不同暴露介質中多壁碳納米管的zeta電位用納米粒度電位儀（Nano-ZS90，馬爾文公司，英國）測定。為能較準確測量zeta電位，選擇多壁碳納米管質量濃度為100 mg·L-1，Cd2+質量濃度為10 mg·L-1。

1.2.3 沉降實驗 多壁碳納米管的懸浮穩定性可通過沉降實驗表征，與細菌接觸的程度也可通過細菌懸液的沉降特征間接得出。沉降實驗振蕩條件與1.2.1相同。其中待測多壁碳納米管質量濃度為100 mg·L-1，Cd2+質量濃度為10 mg·L-1。不同時間測定波長600 nm處多壁碳納米管懸液吸光度（D），隔30 min測定1次，共6次。共沉降率（%）用D/Do表示，其中Do表示初始吸光度。

1.2.4 吸附實驗 碳納米管對重金屬具吸附作用。分別量取1 g·L-1的3種多壁碳納米管與不同質量濃度（1、 2、 4、 8、 10 mg·L-1）Cd2+混合， 配置混合溶液 10 mL， 于（25±1） ℃、 150 r·min-1的恒溫搖床中吸附3 h；待吸附平衡后，將樣品轉移至4 000 r·min-1下離心15 min，取上清液經0.22 μm濾膜過濾；用電感耦合等離子體發射光譜儀（Prodigy7，利曼-徠伯斯公司，美國）測定濾液中溶解Cd2+的質量濃度。計算平衡吸附量 Qe（mg·g-1）=被吸附的 Cd2+的質量（mg）/多壁碳納米管的質量（g）。

2 結果與分析

2.1 不同多壁碳納米管對大腸埃希菌的毒性效應

如圖1所示：隨多壁碳納米管質量濃度升高，大腸埃希菌存活率下降，即多壁碳納米管的細菌毒性增強。毒性從強到弱依次為短多壁碳納米管、短羧基多壁碳納米管、短羥基多壁碳納米管。當多壁碳納米管質量濃度達200 mg·L-1時，大腸埃希菌存活率分別降至70%、80%和90%。

圖1 不同多壁碳納米管對大腸埃希菌的毒性Figure 1 Toxicity of different MWCNTs toward E.coli

2.2 多壁碳納米管及其Cd2+混合物的細菌毒性

由圖2A可知：Cd2+的細菌毒性（對照）隨著質量濃度增加而增強，當Cd2+質量濃度達10 mg·L-1時，大腸埃希菌的存活率為45%。100 mg·L-1的多壁碳納米管與不同質量濃度Cd2+混合，大腸埃希菌的存活率隨Cd2+質量濃度增加而降低；3種多壁碳納米管-Cd2+混合物的復合細菌毒性從強到弱依次為短多壁碳納米管-Cd2+、短羧基多壁碳納米管-Cd2+、短羥基多壁碳納米管-Cd2+。就短羧基多壁碳納米管而言，當Cd2+質量濃度低于4 mg·L-1時，混合物的細菌毒性與Cd2+的單獨毒性幾乎一樣；隨Cd2+質量濃度升高，復合細菌毒性明顯低于Cd2+的細菌毒性。而短羥基多壁碳納米管-Cd2+的復合細菌毒性明顯低于Cd2+的細菌毒性。比較多壁碳納米管-Cd2+的復合細菌毒性和疊加毒性可知：復合細菌毒性小于兩者疊加毒性，即復合細菌毒性是拮抗效應（圖2A）。實際水體環境中，Cd2+質量濃度可能較小，為了進一步明確多壁碳納米管吸附低質量濃度Cd2+后的細菌毒性，固定Cd2+質量濃度至1 mg·L-1。從圖2B可以看出：隨多壁碳納米管質量濃度上升，Cd2+-多壁碳納米管混合物細菌毒性逐漸減弱的，短多壁碳納米管-Cd2+、短羧基多壁碳納米管-Cd2+和短羥基多壁碳納米管-Cd2+的細菌存活率分別從50%、55%和60%變化為70%、80%和85%。相同條件下，復合細菌毒性由大到小依次為短多壁碳納米管-Cd2+、短羧基多壁碳納米管-Cd2+、短羥基多壁碳納米管-Cd2+。多壁碳納米管本身細菌毒性較弱，因此認為多壁碳納米管吸附低質量濃度Cd2+能明顯降低細菌毒性。

圖2 多壁碳納米管吸附Cd2+后混合物細菌毒性變化Figure 2 Toxicity variation of MWCNTs-Cd2+toward E.coli

2.3 多壁碳納米管及其Cd2+混合物的zeta電位

從表1可以看出：3種多壁碳納米管的zeta電位相差不多，在超純水中均帶負電荷；而加入Cd2+后，3種多壁碳納米管的負電荷部分被中和，以短多壁碳納米管表面的負電荷降低最多。

表1 多壁碳納米管顆粒及多壁碳納米管吸附Cd2+后混合物的zeta電位Table 1 Zeta potentials of MWCNTs and its compounds

2.4 多壁碳納米管及其Cd2+混合物與大腸埃希菌的共沉降

如圖3A所示：多壁碳納米管在前30 min沉降速度較快，1 h后沉降基本穩定，懸浮濃度基本保持不變。相比之下，短多壁碳納米管穩定性最差，3 h沉降率約90%，短羥基和短羧基多壁碳納米管穩定性較好，3 h沉降率分別達45%和20%。吸附Cd2+后，短羧基多壁碳納米管-Cd2+混合物的3 h沉降率達50%，略高于短羧基多壁碳納米管。短羧基多壁碳納米管-Cd2+和短羥基多壁碳納米管-Cd2+的沉降率與納米管溶液沉降率幾乎一樣。大腸埃希菌懸液本身不沉降，當在大腸埃希菌懸液中混入多壁碳納米管及其吸附混合物后（圖3B），混合懸液前30 min共沉降速度較快，1 h后沉降基本穩定。3種多壁碳納米管與大腸埃希菌3 h共沉降率分別約40%（短多壁碳納米管）、45%（短羥基多壁碳納米管）和20%（短羧基多壁碳納米管）；3種吸附Cd2+的多壁碳納米管與大腸埃希菌3 h共沉降率分別約45%（短多壁碳納米管）、60%（短羥基多壁碳納米管）和40%（短羧基多壁碳納米管）。

圖3 多壁碳納米管及其Cd2+混合物與大腸埃希菌共沉降Figure 3 Settling properties of MWCNTs and its compounds toward E.coli

2.5 多壁碳納米管對Cd2+的吸附實驗

如圖4所示：當Cd2+質量濃度低于4 mg·L-1時，短多壁碳納米管對Cd2+的吸附量隨著Cd2+的質量濃度增加而增多。當Cd2+的質量濃度大于4 mg·L-1時，吸附量幾乎不變。短羧基和短羥基多壁碳納米管對Cd2+的吸附量隨著Cd2+的質量濃度增加而增多。相同條件下，3種多壁碳納米管對Cd2+的吸附量從大到小依次為短羧基多壁碳納米管、短羥基多壁碳納米管、短多壁碳納米管。

3 討論

3.1 多壁碳納米管細菌毒性的影響機制

多壁碳納米管對大腸埃希菌的毒性主要來自2個方面，一是多壁碳納米管與細菌直接接觸，可能造成刺穿等物理損傷，從而導致細菌死亡；二是多壁碳納米管產生的活性氧自由基對細菌有氧化損傷[11-13]。本研究在黑暗條件下進行，因此排除了活性氧自由基對大腸埃希菌的損傷，多壁碳納米管對大腸埃希菌的細菌毒性主要為直接接觸；受兩者表面電荷影響，多壁碳納米管顆粒與細菌接觸碰撞，可能造成細菌損傷。從zeta電位測定結果可知：多壁碳納米管與大腸埃希菌之間存在靜電斥力，直接接觸能力較弱；短羧基多壁碳納米管和短羥基多壁碳納米管與細菌的共沉降率與顆粒單獨沉降率幾乎一樣，說明此2種多壁碳納米管與大腸埃希菌接觸較少，細菌毒性因而較小。相比之下，短多壁碳納米管與大腸埃希菌的共沉降率最高（60%），說明與細菌接觸的程度最高，因而細菌毒性也最強。

圖4 多壁碳納米管對于Cd2+的吸附Figure 4 Adsorption of MWCNTs to Cd2+

3.2 不同多壁碳納米管及其Cd2+混合物細菌毒性的影響機制

本研究發現：不同官能團多壁碳納米管吸附Cd2+的狀況不同。受溶液pH值[14]、多壁碳納米管的比表面積、表面基團和表面電荷等影響[15-16]，多壁碳納米管對Cd2+的吸附性能不同，吸附方式主要有物理吸附、靜電作用、離子交換和表面絡合，一般以離子交換和表面絡合為主[17]。相同吸附實驗條件下，3種多壁碳納米管管徑和長度一致，對于Cd2+的物理吸附相差不大；吸附性能主要由表面基團決定。羧基和羥基中的氫離子（H+）均可與Cd2+發生離子交換，與羥基相比，羧基與Cd2+的化學鍵能更強，因此短羧基碳納米管吸附Cd2+性能優于短羥基多壁碳納米管[18]及短多壁碳納米管。溶液中被吸附的Cd2+量越大，毒性越弱。因此使得相同條件下，多壁碳納米管及其Cd2+混合物的細菌毒性從高到低為短羧基多壁碳納米管、短羥基多壁碳納米管、短多壁碳納米管。由溶液與細菌的共沉降結果可知：Cd2+可能影響了多壁碳納米管和細菌的共沉降，原因可能是Cd2+降低了短羧基多壁碳納米管和短羥基多壁碳納米管的分散性，減少了兩者與細菌的接觸機會，Cd2+與此2種多壁碳納米管混合物和細菌的共沉降率減小，而Cd2+與短多壁碳納米管的細菌共沉降率略微增大，可能與zeta電位值有關。本研究發現：Cd2+降低了多壁碳納米管表面的負電荷，Cd2+存在條件下多壁碳納米管與大腸埃希菌之間的靜電斥力降低，即多壁碳納米管與大腸埃希菌直接接觸機會增加，從而使得細菌毒性增強。

4 結論

相同條件下，3種多壁碳納米管的細菌毒性從強到弱依次為短多壁碳納米管、短羧基多壁碳納米管、短羥基多壁碳納米管。多壁碳納米管和Cd2+混合后，納米管表面負電荷被降低，與細菌間靜電斥力降低，直接接觸毒性增強；同時Cd2+被納米管吸附，自身毒性降低。3種多壁碳納米管與Cd2+混合物的細菌毒性均低于納米管和重金屬的毒性，其中短羥基多壁碳納米管-Cd2+混合物的細菌毒性最低，其次為短羧基多壁碳納米管。短多壁碳納米管對Cd2+的吸附能力最弱，因此短多壁碳納米管-Cd2+的細菌毒性要高于其他2種混合物。