寄主植物、溫度對金銀花尺蠖幼蟲消化酶活性的影響

向玉勇，孫 星，殷培峰

（滁州學院 生物與食品工程學院，安徽 滁州 239000）

植食性昆蟲通過取食寄主植物來獲取生長發育所需的糖類、蛋白質和脂肪等營養物質。昆蟲中腸上皮細胞能形成和分泌消化酶，將這些營養物質消化分解成小分子物質供生長發育需要，如纖維素酶可將纖維素水解成葡萄糖[1]；α-淀粉酶可將淀粉等多糖水解成為麥芽糖、葡萄糖、果糖等，參與體內的能量代謝[2]；蛋白酶能將蛋白質水解為氨基酸，為昆蟲的生長和繁殖提供氮源[3]；脂肪酶可將三酰基甘油、磷脂、酰基甘油分解生成游離脂肪酸[4]。食性不同的昆蟲消化酶種類和活性不同，食性相同的昆蟲取食不同的寄主，甚至同種不同生長階段的寄主，消化酶活性也存在差異[5]。如賈冰等[6]報道：在棉花Gossypium hirsutum和苜蓿Mdicago sativa上飼養牧草盲蝽Lygus pratensis，成蟲的淀粉酶活性顯著高于其他供試植物。李藝瓊等[7]報道：椰心葉甲Brontispa longissima 5齡幼蟲取食椰樹 Cocos nucifera半展葉、展葉后，中腸的蔗糖酶、淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶活性均比取食心葉的幼蟲顯著下降。同時，環境因子的變化也會影響昆蟲體內消化酶的活性及隨后的生理過程。姜麗娜等[8]報道：隨著二氧化碳濃度的升高，四季豆Phaseolus vulgaris、黃瓜Cucumis sativus、辣椒Capsicum annuum和茼蒿Chrysanthemum coronarium飼養的西花薊馬Frankliniella occidentalis和花薊馬Frankliniella intonsa成蟲體內的淀粉酶活性均降低，脂肪酶和胰蛋白酶的活性則升高。然而,有關溫度對消化酶活性的影響以魚類、爬行類、甲殼類動物研究得較多[9-11]。關于溫度對昆蟲消化酶活性的影響還未見相關報道。消化酶活性的高低決定了昆蟲對營養物質消化、吸收的能力，從而影響昆蟲生長發育速度。研究寄主植物及環境因子對昆蟲消化酶活性的影響，可為深入探討昆蟲與環境適應性的生理生化機制奠定基礎。金銀花尺蠖Heterolocha jinyinhuaphaga屬鱗翅目Lepidoptera尺蛾科Geometridae昆蟲，別名拱腰蟲，是金銀花 Lonicera japonica主要食葉害蟲之一，常將金銀花葉片咬成缺刻或孔洞，甚至全部吃光，常造成金銀花的大面積減產，甚至成片死亡，給金銀花生產帶來嚴重損失[12-14]。目前，國內關于金銀花尺蠖生物學特性及防治已有較多研究[12-16]，而寄主植物及環境因子對其幼蟲消化酶活性的影響還未見相關報道。本研究探討了不同寄主植物、溫度對金銀花尺蠖幼蟲淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶和脂肪酶活性的影響，分析金銀花尺蠖幼蟲對不同環境因子的生理生化適應性，為深入研究金銀花尺蠖環境適應性的生理生化機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

金銀花尺蠖幼蟲采集于安徽省明光市三界鎮野生金銀花上，帶回，在人工氣候箱（RXZ-288A型，寧波江南儀器制造廠）中飼養。設置人工氣候箱光周期為14 h/10 h，溫度為（25±1）℃，相對濕度為70%±7%。將幼蟲放在600 mL的罐頭瓶內（每瓶放10頭幼蟲），每天采摘新鮮的金銀花葉片飼養。待其化蛹后，用濕潤紗布鋪于瓶底，每天定期檢查羽化情況，把同日羽化的雌雄成蟲配對后放于同一養蟲籠內，用質量分數為10%的蔗糖水作食物，讓其交配產卵。

1.2 寄主植物對金銀花尺蠖幼蟲消化酶活性的影響

取剛孵化的金銀花尺蠖幼蟲，單頭放在罐頭瓶中，然后放在人工氣候箱中[光周期設置為14 h/10 h，溫度設置為（25±1）℃，相對濕度設置為70%±7%]，分別用4種金銀花 （‘九豐1號’‘Jiufeng No.1’、‘響水1號’‘Xiangshui No.1’、‘響水2號’‘Xiangshui No.2’、野生種）新鮮葉片飼養，用濕棉花包裹葉片基部以保持葉片新鮮，每天9：00更換新鮮葉片，一直飼養到5齡（根據頭殼寬度判斷）。每種金銀花1次飼養20頭幼蟲，重復4次。

1.3 溫度對金銀花尺蠖幼蟲消化酶活性的影響

25℃左右是金銀花尺蠖取食的最適溫度[17]，因此，設16、19、22、25、28、31、34℃等7個溫度處理，設置光照周期為14 h/10 h，相對濕度為70%。取剛孵化的金銀花尺蠖幼蟲，單頭放在各個罐頭瓶中，并放入新鮮金銀花 （‘九豐1號’）葉片（用濕棉花包裹葉片基部以保持葉片新鮮，每天定時更換葉片），一直飼養到5齡。每個溫度處理下1次飼養20頭幼蟲。重復4次。

1.4 酶液制備

每處理挑取大小一致的5齡幼蟲10頭，用去離子水洗凈，濾紙擦干，冰浴中迅速取出中腸，加入預冷的磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.02 mol·L-1，pH 8.0）5.0 mL，迅速研磨成勻漿，離心15 min（-4℃，15 000 r·min-1），取上清液作酶液。以牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白，采用考馬斯亮藍G-250染色法測定樣品蛋白含量[18]。

1.5 淀粉酶活性測定

采用3,5-二硝基水楊酸法[19]。在試管中分別加入酶液80 μL、質量分數為2%淀粉0.2 mL和0.2 mol·L-1PBS（pH 6.0）0.8 mL，搖勻，室溫下反應10 min，37℃水浴中保溫60 min，加入3,5-二硝基水楊酸1.0 mL終止反應，沸水浴加熱5 min，冷卻后于550 nm波長測吸光值。空白對照用80 μL 0.2 mol·L-1PBS（pH 6.0）代替酶液。采用麥芽糖標準曲線計算樣品反應后麥芽糖的含量。淀粉酶活性以每分鐘每克樣品蛋白催化水解生成麥芽糖的量（mmol·g-1·min-1）表示。重復4次。

1.6 蔗糖酶活性測定

采用3,5-二硝基水楊酸法[19]。在試管中分別加入酶液80 μL、質量分數為4%蔗糖0.2 mL和0.2 mol·L-1PBS（pH 5.8）0.8 mL，搖勻，室溫下反應10 min，37℃水浴中保溫60 min，加3,5-二硝基水楊酸1.0 mL終止反應，沸水浴加熱5 min，冷卻后于550 nm波長測吸光值。用80 μL 0.2 mol·L-1PBS（pH 5.8）代替酶液做空白對照。采用葡萄糖標準曲線計算樣品反應后葡萄糖含量。蔗糖酶活性以每分鐘每克樣品蛋白催化水解生成葡萄糖的量（mmol·g-1·min-1）表示。重復4次。

1.7 蛋白酶活性測定

采用福林-酚法[7]。在試管中加入酶液40 μL和質量分數為0.5%酪蛋白溶液100 μL，混勻后水浴15 min（37℃），加入質量分數為10%三氯乙酸100 μL，混勻，離心15 min（10 000 r·min-1，4℃）。取上清液 150 μL，分別加入 0.55 mol·L-1碳酸鈉溶液 750 μL和 Folin-酚試劑 150 μL， 混勻后水浴 15 min（37℃），然后于680 nm處測量吸光值。空白對照以緩沖液代替酶液，采用酪氨酸標準曲線計算樣品反應后酪氨酸含量。蛋白酶活性以每分鐘每克樣品蛋白催化水解生成酪氨酸的量（mmol·g-1·min-1）表示。重復4次。

1.8 脂肪酶活性測定

采用標準氫氧化鈉溶液滴定法[7]。取PBS緩沖液（0.025 mol·L-1，pH 7.5）0.5 mL，放入10 mL試管中，加入聚乙烯醇橄欖油乳液0.4 mL，搖勻，40℃水浴加熱10 min，加入酶液0.5 mL，繼續加熱20 min（40℃水浴），加入體積分數為95%乙醇1.5 mL和1滴體積分數為1%酚酞指示劑。用標準氫氧化鈉溶液（0.05 mol·L-1）滴定至微紅色，記錄所消耗的氫氧化鈉體積。脂肪酶活性以每分鐘每克樣品蛋白催化水解生成脂肪酸的量（mmol·g-1·min-1）表示。對照以緩沖液代替酶液。重復4次。

1.9 數據分析

用SPSS 11.5進行方差分析，采用Duncan氏新復極差法在P＜0.05水平上進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 寄主植物對金銀花尺蠖幼蟲消化酶活性的影響

取食不同金銀花后，金銀花尺蠖各齡幼蟲的消化酶活性均不相同（表1）。取食野生金銀花的淀粉酶、蔗糖酶和蛋白酶活性最高，在1齡幼蟲中分別為18.37、26.45和22.31 mmol·g-1·min-1。1齡幼蟲取食野生金銀花、‘九豐1號’和‘響水2號’的淀粉酶活性之間差異不顯著（F3,8=3.147，P=0.954），但與響水1號差異顯著（P＜0.05）；1齡幼蟲取食這4種寄主植物的蔗糖酶活性之間（F3,8=1.379，P=0.317）、蛋白酶活性（F3,8=2.455，P=0.138）之間差異不顯著。取食‘響水1號’的脂肪酶活性最高，在1齡幼蟲中為 7.54 mmol·g-1·min-1， 取食野生金銀花的脂肪酶活性最低， 在 1齡幼蟲中為 5.54 mmol·g-1·min-1。 1齡幼蟲取食‘九豐1號’、‘響水1號’和‘響水2號’的脂肪酶活性之間，以及取食‘響水2號’與野生金銀花的脂肪酶活性之間差異不顯著（F3,8=2.238，P=0.061）。

金銀花尺蠖幼蟲取食‘九豐1號’、‘響水1號’、‘響水2號’和野生金銀花的淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶和脂肪酶活性均隨著幼蟲齡期的增加而增大，5齡幼蟲取食這4種金銀花的淀粉酶活性分別為23.45、 19.67、21.65和 26.69 mmol·g-1·min-1， 分別比 1齡幼蟲增加了 33.39%、27.48%、33.31%和45.29%。5齡幼蟲取食這4種金銀花的蔗糖酶活性分別為30.53、27.79、28.34和34.29 mmol·g-1·min-1，分別比1齡幼蟲增加了19.12%、15.02%、14.64%和29.64%。5齡幼蟲取食這4種金銀花的蛋白酶活性分別為27.42、23.12、24.74和31.56 mmol·g-1·min-1，分別比1齡幼蟲增加了25.55%、18.69%、21.69%和41.46%。5齡幼蟲取食這4種金銀花的脂肪酶活性分別為11.43、12.67、11.57和9.85 mmol·g-1·min-1，分別比1齡幼蟲增加了84.95%、68.04%、68.41%和77.80%。方差分析顯示：寄主植物、幼蟲齡期對金銀花尺蠖幼蟲4種消化酶活性均有顯著影響（P＜0.05），但寄主植物和幼蟲齡期的交互作用對金銀花尺蠖幼蟲4種消化酶活性沒有顯著影響（P＞0.05）。

2.2 溫度對金銀花尺蠖幼蟲消化酶活性的影響

不同溫度下金銀花尺蠖取食‘九豐1號’鮮葉后，各齡幼蟲消化酶活性均不相同（表2），在16～34℃均呈先上升后下降的趨勢。1～5齡幼蟲的淀粉酶活性在22℃最高，分別為19.95、20.57、21.79、23.64和25.86 mmol·g-1·min-1，高于或低于22℃，淀粉酶活性均下降；1～5齡幼蟲的蔗糖酶活性也在22℃最高，分別為27.65、28.89、29.85、31.45和32.89 mmol·g-1·min-1，高于或低于22℃，蔗糖酶活性均下降；1～5齡幼蟲的蛋白酶活性在25℃時最高，分別為21.65、22.76、23.43、25.71和26.98 mmol·g-1·min-1，高于或低于25℃，蛋白酶活性均下降；1～5齡幼蟲的脂肪酶活性在28℃時最高，分別為7.38、8.49、9.81、11.33和13.21 mmol·g-1·min-1，高于或低于28℃，脂肪酶活性均下降。方差分析顯示：溫度和幼蟲齡期的交互作用對金銀花尺蠖幼蟲4種消化酶活性沒有顯著影響（P＞0.05）。

表1 不同寄主植物下金銀花尺蠖幼蟲4種消化酶活性的變化Table 1 Change of host plants on four digestive enzymes activities in H.jinyinhuaphaga larva

根據不同溫度下金銀花尺蠖1～5齡幼蟲4種消化酶活性的變化趨勢進行回歸分析，回歸模型見表3。對模型進行計算，得出金銀花尺蠖1～5幼齡蟲淀粉酶活性最高的溫度分別為21.39、20.60、20.48、20.50和21.20℃；蔗糖酶活性最高的溫度分別為21.83、21.11、20.89、20.96和21.12℃；蛋白酶活性最高的溫度分別為24.70、24.97、25.51、25.24和24.35℃；脂肪酶活性最高的溫度分別為28.41、28.08、27.52、28.69和29.30℃。

3 討論

表2 不同溫度下金銀花尺蠖幼蟲4種消化酶活性的變化Table 2 Change of temperature on four digestive enzymes activities in H.jinyinhuaphaga larva

昆蟲體內的消化酶活性與取食密切相關。昆蟲取食寄主植物后依靠消化酶將其中的營養物質轉化為自身所需的物質，消化酶活性的高低在一定程度上反映了昆蟲所需營養的種類，以及各類營養物質被昆蟲利用的狀況，常可以用來表示昆蟲對植物的嗜食程度[20]。在取食不同寄主植物時，昆蟲可以根據自身生長發育的需求調節體內消化酶的活性[8]。本研究表明：金銀花尺蠖各齡幼蟲取食野生金銀花的淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶活性均高于其他寄主，而脂肪酶活性低于其他寄主。向玉勇等[21]研究發現：金銀花尺蠖幼蟲對4個品種金銀花的取食量大小均從高到低依次為野生品種、‘九豐1號’、‘響水2號’、‘響水1號’，野生金銀花葉片可溶性糖含量、蛋白質含量均高于其他寄主，脂肪含量低于其他寄主。這說明金銀花尺蠖幼蟲取食營養成分含量高的寄主時，其消化酶活性會升高。這可能是金銀花尺蠖對不同寄主的一種自我生理調節，取食營養成分含量高的寄主時，通過提高自身消化酶活性分解大量的營養物質，以保證機體的快速生長。但其他種類昆蟲則存在不一致的現象，如棉鈴蟲Helicoverpa armigera幼蟲在取食糖類含量較高的寄主植物時，淀粉酶活性會下降，在取食蛋白含量高的寄主植物時，中腸蛋白酶活性會下降[22]；椰心葉甲Brontispa longissima 5齡幼蟲取食營養豐富的葉片后，中腸的蔗糖酶、淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶活性均顯著下降[7]。這說明取食不同寄主植物時，不同昆蟲的消化酶活性變化存在差異，這些昆蟲體內可能存在另一種機制，當寄主植物營養成分含量高時，利用較低的消化酶活性就可以滿足機體的新陳代謝[23]。金銀花尺蠖幼蟲取食金銀花的淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶和脂肪酶活性均隨著幼蟲齡期的增加而增大。寄主植物和幼蟲齡期的交互作用對金銀花尺蠖幼蟲4種消化酶活性沒有顯著影響。

表3 金銀花尺蠖幼蟲4種消化酶活性（y）與溫度（x）間的回歸模型Table 3 Regression model about four digestive enzymes activities （y） in H.jinyinhuaphaga larva at different temperatures （x）

溫度是影響昆蟲生理代謝過程的重要環境因子。不同溫度下金銀花尺蠖各齡幼蟲體內淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶和脂肪酶活性均不一樣，在16～34℃，這4種消化酶活性均隨著溫度的升高表現為先上升后下降的趨勢。在波紋龍蝦Panulirus homarus[11]、嘉陵江鲇Silurus asotus[24]等其他變溫動物也存在類似現象。這可能是低溫下這些酶的活化分子數比較少，催化食物分解的反應速率低，隨著溫度上升，酶的活化分子逐漸增多，催化反應速率加快，酶的催化活性增強，高溫下這些酶蛋白發生變性，酶的催化活性又下降。在刺參 Apostichopus japonicus[25]中卻存在不一致的現象，在6～21℃，其胰蛋白酶與淀粉酶活力隨水溫升高呈先升高后降低的趨勢,而脂肪酶活力隨著養殖水溫升高呈下降趨勢。這表明：不同種類動物的消化酶對溫度的耐受性存在差異。金銀花尺蠖各齡幼蟲體內4種消化酶的最適溫度不同，淀粉酶和蔗糖酶活性在22℃最高，蛋白酶活性在25℃時最高，脂肪酶活性在28℃時最高。這與金銀花尺蠖的生長氣候條件相吻合，金銀花在春夏季生長迅速，尤其在夏季多雨期，而金銀花尺蠖消化酶活性恰好在22～28℃最高，有利于對食物的消化，加速生長發育，導致其大發生。

總之，寄主植物、溫度均對金銀花尺蠖幼蟲消化酶活性產生影響，不同寄主植物不僅含有不同含量的營養物質，而且還含有不同的抑制因子以及次生代謝物質，寄主植物的任何變化都會影響消化酶的活性及隨后的生理過程[26,8]。因此，還應進一步研究不同寄主植物的次生物質與金銀花尺蠖幼蟲體內消化酶活性的變化情況，以更深入地闡明金銀花尺蠖與環境適應性的生理生化機制。