香榧癭螨為害對香榧葉片結構及葉綠素質量分數的影響

錢宇汀，薛曉峰，曾燕如，陳文充，葉曉明，喻衛武，戴文圣

（1.浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州311300；2.南京農業大學 植物保護學院 昆蟲學系，江蘇 南京210095）

香榧Torreya grandis‘Merrillii’是榧樹Torreya grandis經人工嫁接繁殖而成的優良栽培類型[1]，具有極高的經濟價值、生態價值和文化價值，是集材用、藥用、果用、油用和觀賞于一體的多功能珍貴樹種[2-3]。近幾年香榧產業發展迅速，使得香榧產區有了很大的擴展。新老產區香榧林多為純林，在相對單一的生態環境中易成片感染各種病蟲害。香榧癭螨Nalepella abiesis是香榧的主要蟲害之一，其種名最初鑒定為冷杉大嘴癭螨 Rhyncaphytopus abiesis[4]， 2013年經重新分類后更名為Nalepella abiesis[5]。 國外尚無該種癭螨的相關報道。癭螨是一類古老的高度微型化、形態簡化和多樣化的植食性寄生螨[6]，大多數種類對寄主植物具有高度專一性[7]。癭螨靠其螯肢演化的口針刺入寄主組織，以吸食細胞里的汁液和營養物質為生[8]。癭螨可以為害植物的葉、芽、果實、莖干等部位，大部分癭螨屬于自由生活型，寄生在植物表面，少部分能引起寄主植物產生各種蟲癭、毛氈等癥狀[9]，使寄主植物器官發生畸形，組織結構發生改變。香榧癭螨屬于寡食性昆蟲，且自由生活在香榧樹體地上部分的器官表面，以葉片為主要寄生場所。目前，關于香榧癭螨的研究甚少，僅有一些關于香榧癭螨生物學特性和發生規律[4,10-11]及防治[11]的研究報道，但針對癭螨吸食為害香榧葉片部位卻存在著不同說法[12]。本研究從植物形態解剖學的角度探究香榧癭螨為害對香榧葉片結構及葉綠素質量分數的影響，以期對香榧癭螨的為害機理和防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

香榧癭螨采自浙江省嵊州市谷來鎮（29°41′N，120°38′E），該鎮為香榧老產區。香榧癭螨帶回實驗室后在室內用新鮮香榧葉片繼代飼養，并用體式顯微鏡對其進行觀察。香榧苗來自浙江省諸暨市立勤香榧種植基地長勢一致的2+3（2年生實生苗嫁接后再栽培3 a）香榧盆栽苗（盆徑25 cm）。

1.2 試驗方法

1.2.1 癭螨接種 試驗于2018年9-10月在浙江農林大學國家林業和草原局林木良種繁育基地溫室大棚（30°15′N，119°43′E）內進行。香榧葉條形，近對生于枝條的兩側，上表面光綠色，下表面有2條白色氣孔帶[1]。選擇健康無病蟲害且葉片大小、數量基本一致的香榧1年生成熟枝條，按30頭·枝條-1的蟲口密度，用0號帶微鉤的昆蟲針輕輕地將香榧癭螨接種到枝條葉表上，以未接種癭螨的盆栽苗為空白對照組。每個處理重復3次，每重復5盆苗。每盆苗之間均保持一定的距離，對每個接螨的枝條于基部節處涂抹凡士林以防止癭螨爬出供試枝條[13]，并保持供試枝條隔離無交叉感染。依次在癭螨侵染的第0天（即健康葉片）、第12天、第25天和第40天，分別剪取2個處理的香榧葉片，將每個重復的葉片各自混勻。采集的葉片用于形態解剖學的觀察和總葉綠素質量分數的測定，使用前先用紙巾擦除葉表的癭螨。

1.2.2 形態解剖學觀察 ①葉片組織結構。選取實驗葉片靠中間部位切成1 mm×2 mm大小的塊狀，將塊狀葉置于體積分數2.5%的戊二醛溶液中4℃條件下固定過夜；然后將樣品用磷酸緩沖液（pH 7.0）漂洗3次，用質量分數1.0%的鋨酸固定1.5 h，再用磷酸緩沖液漂洗3次；后用300、500、700、800、900、950 g·kg-1梯度的乙醇溶液逐級脫水，用Spurr包埋劑與丙酮混合液進行滲透過夜；用半薄切片機（瑞典LKB 11800）切片，經亞甲基藍染色后在正置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS BX 60）下觀察、拍照。②葉片氣孔帶結構。樣品雙固定、脫水方法同葉片組織結構，經臨界點干燥、鍍膜后在掃描電鏡（日本Hitacbi TM-1000）下觀察、拍照。③葉綠體超微結構。樣品雙固定、脫水、滲透處理方法同葉片組織結構，包埋好的樣品用超薄切片機（日本Leica EM UC7）切片，經檸檬酸鉛溶液和乙酸雙氧鈾染液染色后，在透射電鏡（日本JEM-1230）下觀察、拍照。

1.2.3 葉綠素質量分數測定 采用乙醇浸泡法[14]，用紫外-可見分光光度計（日本UV-2600）全光譜掃描測定波長665 nm處的吸光值D（665）和649 nm處的吸光值D（649），并按公式計算鮮葉葉綠素質量分數，葉綠素質量分數（mg·g-1）=0.1×[18.08×D（649）+6.63×D（665）]。數據采用 Excel 2007 與 SPSS 17.0 進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 香榧癭螨生物學特性觀察

體式顯微鏡下觀察螨害下的香榧葉片，發現香榧癭螨可以吸食為害香榧植株的葉片上、下表面（圖1）。經長期觀察發現，成螨多集中于香榧葉片上表面吸食（圖1A～B），并且雌成螨基本在香榧葉背2條白色氣孔帶上產卵，卵呈透明狀的橢球形（圖1B～C）。

圖1 體式顯微鏡下觀察香榧癭螨Figure 1 Stereomicroscope observation of N.abiesis

2.2 癭螨為害香榧葉片組織結構的動態變化

正置顯微鏡下觀察癭螨為害不同天數的香榧葉片組織結構，發現健康葉片上、下表皮均由一層緊密排列的細胞組成，不含葉綠體，表皮外覆著一層較薄的角質層；氣孔器分布在下表皮，略內陷，由2個保衛細胞控制其開閉，周圍密生分叉的角質釘（圖2A），這與前人有關榧樹屬Torreya植物解剖特征的描述[15-16]一致；葉肉組織發達且明顯分化為柵欄組織和海綿組織，柵欄細胞呈長圓柱狀，垂直于葉表皮，且排列較緊密，內含較多的葉綠體，海綿細胞呈不規則的橢圓形或圓形，排列較為疏松（圖2A）。隨著螨害時間的持續，柵欄組織和海綿組織細胞形狀發生改變，但上、下表皮細胞未見有明顯破損（圖2B～D）。從螨害第40天的葉片結構可見，柵欄組織厚度明顯減小，細胞數量減少，尤其是下表皮上方的柵欄細胞；海綿細胞亦縮水變小，且細胞間隙變大而更為松散；氣孔角質釘結構有所破損，保衛細胞縮小（圖 2D）。

2.3 螨害對香榧葉片氣孔結構的影響

掃描電鏡下觀察健康與螨害第40天的香榧葉片氣孔結構，發現健康葉片的氣孔呈狹長橢圓形（圖3A～B，示半閉合狀態的氣孔），被乳突狀角質釘包圍而內陷，而角質釘高度密集，呈無規則分布（圖3A）。癭螨為害后的葉片氣孔有明顯的損傷和萎縮（圖3D）。氣孔周圍的角質釘上附著有香榧癭螨的卵（圖3C），卵在樣品制備過程中因漂洗等操作而破裂或脫落。完整的卵呈橢圓形，平均大小為49.87 μm×39.48 μm；相比健康葉片，螨害后的角質釘表面附著了更多的絮狀絨毛狀物（圖3D）。

2.4 癭螨為害香榧葉肉細胞超微結構的動態變化

透射電鏡下觀察癭螨為害不同天數香榧葉肉細胞超微結構，發現健康葉片的葉肉細胞間有一定的空隙，相鄰細胞壁界限明顯，細胞內葉綠體數量較多，且緊貼細胞壁分布，線粒體也比較豐富（圖4A）。單個葉綠體的基粒片層垛疊緊密，結構清晰良好，體內嗜鋨顆粒不多（圖4E）。隨著螨害時間的持續，葉肉細胞逐漸膨脹變形，細胞間隙變大；葉綠體數量逐漸減少，體內出現膨大的淀粉粒；線粒體數量亦減少（圖4B～D）。螨害第12天（圖4F），葉綠體內嗜鋨顆粒數量明顯增多，基粒片層排列逐漸散亂，結構不清晰，至螨害第25天變得模糊（圖4G）。螨害第40天，葉肉細胞內大部分葉綠體膜被破壞，體內有淀粉粒沉積，并脫離細胞壁散亂地分布在細胞質中，片層結構瓦解甚至消失（圖4H）。

圖2 癭螨為害香榧葉片組織結構的動態變化Figure 2 Dynamic changes in the leaf tissue structure on different days after inoculation with mites

圖3 健康與螨害40 d香榧葉片氣孔的掃描結構的比較Figure 3 A comparison in the leaf stomatal structure between healthy and 40-day mite-hurt leaves under the scanning electron microscope

2.5 癭螨為害香榧葉片葉綠素質量分數的動態變化

圖4 癭螨為害香榧葉肉細胞超微結構的動態變化Figure 4 Dynamic changes in the ultrastructure of a mite-hurt mesophyll cell

相同螨害天數下，0～12 d處理與對照的葉綠素質量分數無顯著差異，但在接種癭螨25～40 d處理與對照間葉綠素質量分數達差異顯著水平，癭螨處理葉片的葉綠素質量分數下降很快，說明癭螨為害隨著時間的推移影響逐漸增強。癭螨為害期處理與對照香榧葉片葉綠素質量分數動態發現，對照與處理香榧葉片葉綠素質量分數均呈下降趨勢，但對照組0～12 d有輕微的下降，12 d后不同時間點間差異不顯著；而螨害處理0～12 d香榧葉片葉綠素質量分數無顯著下降，12 d后不同時間點間葉片葉綠素質量分數下降明顯，差異顯著（P＜0.05），在癭螨接種第25～40天，葉綠素質量分數從3.91 mg·g-1下降至3.3 mg·g-1；螨害第40天與第0天相比，葉綠素質量分數下降了25.34%（圖5）。另外，通過F檢驗發現：癭螨為害持續天數對葉綠素質量分數變化有顯著影響（F=25.331，P＜0.05）。說明螨害導致葉綠素減少，從而影響葉片進行正常的光合作用。

3 討論

逆境脅迫有多種，其中蟲害脅迫是常見的一類生物脅迫[17]。不同脅迫會對植物造成不同程度的為害，同樣螨害會引起植物葉片細胞結構[18]、生理[19]、 生化[20]等方面的 變化，這些變化反映植物體對逆境脅迫的響應。香榧葉片被香榧癭螨刺吸式取食后，葉片組織細胞在形態結構、生理生化等方面產生了一系列變化。本研究表明：香榧葉片的下表皮上也有柵欄細胞，香榧癭螨主要為害香榧葉片的葉肉組織，癭螨為害后柵欄組織厚度明顯減小，而柵欄組織是大量葉綠體存在的部位，進而影響葉綠素質量分數。結合體式顯微鏡下的觀察，認為香榧癭螨在香榧葉片上、下表面都有刺吸取食的行為。實驗觀察發現，成螨更喜歡在香榧葉片上表面取食，這可能跟與上表皮相連的柵欄組織厚且細胞內容物多有關。寄主植物的葉片下表皮是螨蟲躲藏的主要場所，葉片氣孔更是螨蟲口針探入海綿組織的天然孔道[8]，持續螨害使得氣孔有明顯的損傷和萎縮，嚴重影響了氣孔的正常開閉，從而直接影響葉片的蒸騰作用和氣體交換。由于保衛細胞內也含有少量葉綠體，推測其也可能是被香榧癭螨刺吸后縮水變小[21]。另外，通過體式顯微鏡觀察發現，香榧癭螨偏好在葉片氣孔帶上集中產卵，一方面葉片乳突狀的結構為卵提供了更好的附著點，另一方面紅豆杉屬Taxus葉片氣孔帶的角質乳突具有抵御低溫侵襲的功能[22]，加上植物通過氣孔蒸騰失水，氣孔處所保持的濕度也為卵提供了合適的孵化條件。此外，葉片氣孔密度一直是抗螨性的研究熱點，氣孔密度與植株抗螨性呈負相關[21,23]，這為后續選育抗螨性較強的香榧種質提供了研究思路。

圖5 癭螨為害香榧葉片葉綠素質量分數的動態變化Figure 5 Dynamic changes in the leaf chlorophyll content with days after inoculatio with mites

葉綠體是植物體內最主要的細胞器之一，它的主要功能是進行光合作用，其結構的完整性與其功能的發揮緊密關聯，而葉綠體對環境脅迫又比較敏感[24]。超微結構研究表明：葉綠體對香榧癭螨脅迫反應非常敏感。螨害后的葉綠體片層結構受損，膜系統被破壞，影響了光合產物的正常輸出，導致葉綠體中有淀粉粒的沉積[18]，無法進一步降解轉化。葉綠體內嗜鋨顆粒數量的增加，跟葉綠體的衰老退化有關[25]，這具有一定的生理學意義。螨害使葉綠體數量減少，葉綠素質量分數減少，葉片逐漸失綠，繼而枯萎脫落，直接導致香榧葉片光合能力下降，無法合成更多的養分，進而影響香榧的正常生長。

綜上所述，香榧癭螨吸食破壞了香榧葉片葉肉細胞和氣孔器的結構，使得葉綠素質量分數減少，從而影響了香榧葉片正常的光合作用。