文冠果優良無性系授粉組合選擇及結實性狀分析

牛 媛，敖 妍，李 云，田秀銘，楊長文，劉小天，李志虹

（1.北京林業大學 省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室，北京100083；2.北京林業大學 國家能源非糧生物質原料研發中心，北京 100083；3.國家林業和草原局調查規劃設計院，北京 100714；4.朝陽市果樹技術推廣站，遼寧 朝陽 122000；5.遼寧文冠實業開發有限公司，遼寧 朝陽 122000；6.科右前旗農牧和科技局農業研究所，內蒙古 興安盟137713）

文冠果Xanthoceras sorbifolium為無患子科Sapindaceae文冠果屬Xanthoceras植物，是少數適合中國北方地區重點發展的生物質能源樹種，具有抗寒、抗旱能力強，結實早的特性。文冠果種仁含油率高達67%，可用于生產生物柴油及高級潤滑油等工業用油；籽油富含不飽和脂肪酸，可用于生產高級食用油。油粕可做高級飼料，種仁可制作果汁露，其中的藥用成分可用于治療心血管病、遺尿癥等疾??；果殼可生產活性炭、糠醛、皂苷等[1-5]。文冠果種實開發利用前景廣闊，且其嫁接苗第2年、播種苗第3年即可結實。一定年限內，種子產量隨樹齡增長遞增，8～10 a進入盛果期，結果期可達百年，具有見效快、附加值高、經濟效益明顯的特點。但是，目前低產仍是文冠果種實開發利用產業發展的主要限制因素，其原因除了缺乏集約的栽培管理措施外，還與文冠果雌雄比例低、自交不親和等生物學特性有很大關系[6-8]。多數自交不親和樹種如薄殼山核桃Carya illinoensis、杏Armeniaca vulgaris、梨 Pyrus spp.等，利用不同品種花粉控制授粉，分析雜交組合坐果率、果實品質，確定最佳授粉樹，提高產量[9-11]。文冠果栽培授粉樹配置的重要性還未引起重視，一方面影響文冠果坐果率和種實產量的提高；另一方面，在無性系化推廣時[12-13]會出現 “優樹不優”現象，影響文冠果優良性狀的表現?？茖W的授粉樹配置除要考慮授粉樹與主栽品種花期相遇時間長短、親和性強弱之外，也應兼顧授粉后種實產量及果實品質。本研究以文冠果5個優良無性系為試材，確定其花期物候和最佳授粉時期，通過設計交互授粉、混合授粉、自然授粉，綜合分析各授粉組合坐果情況、種實產量及種實性狀，得到各無性系的最佳授粉組合，為文冠果優質豐產栽培及優良種質無性系化推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與試驗材料

試驗地位于遼寧省朝陽市大平房鎮原家洼村文冠果基地（41°25′N，120°16′E），屬北溫帶大陸性季風氣候，年均日照2 861.7 h，年均氣溫為8.4℃，無霜期為158.0 d，年均降水量為489.0 mm。土壤類型為褐土，土層厚度100 cm左右。供試材料是2016年7月嫁接的生長健壯、無病蟲害的10號、14號、15號、16號、119號優良文冠果無性系各56株。接穗采自遼寧省朝陽市文冠果基地的15年生實生苗，砧木為1年生干2年根的文冠果實生苗。試驗用嫁接苗平均樹高107.3 cm，平均地徑2.6 cm，株行距1.5 m×1.5 m，常規管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 花期物候觀測 各無性系隨機選取10株作為花期物候觀測樣株。各樣株樹體東、南、西、北4個方向選取標準枝編號標記，于2018年4月24日至5月15日，每天8：00和16：00觀測標準枝上開花數量，并統計開花數量占整個花序總花數量的百分比，10株樣株中有一半以上植株達到某物候相標準時，記錄該物候開始日期。物候相標準：25%～50%的花開放為初花期；50%～75%的花開放為盛花期；75%～95%的花開放為末花期[14-15]。

1.2.2 柱頭可授性檢測 各無性系另選10株作為柱頭可授性和花粉活力檢測取樣植株。于盛花期分別采集花蕾初開放（圖1A①）、開花當天（花蕾完全開放，圖1A②）、花后1～5 d的雌能花（圖1A③～⑦），每無性系每時期取20朵，用聯苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性[16]。

1.2.3 花粉活力檢測 開花前1 d在取樣植株上標記即將開放的雄能花，每天9：00分別采集處于花蕾初開放（圖1B①）、開花當天（花蕾完全開放，圖1B②）、花后1 d（圖1B③）3個階段的雄能花。每無性系每時期取20朵，采用固體培養基法（質量分數分別為0.50%、10.00%和0.03%的瓊脂、蔗糖和硼酸）檢測花粉活力[17]。

圖1 文冠果開花不同時期雌能花和雄能花Figure 1 Female and male flowers in different flowering stages of X.sorbifolium

1.2.4 授粉試驗 各無性系另選36株作為授粉試材，設計交互授粉、混合授粉和自然授粉，其中混合授粉所授花粉為5個無性系混合花粉（mixed pollination,MP），自然授粉組（ck）為對照。因文冠果成熟果實均來自異花授粉[7-8]，故不設計自交授粉。授粉配置設計見表1。每個授粉組合每重復授粉100朵雌能花，3次重復。因文冠果雌能花花藥不開裂，故不去除雌能花雄蕊，在開花前1 d識別、去除將要授粉花序上的雄能花和已經開放的雌能花，套袋即可。授粉時，采集正在散粉的雄能花，除去花瓣，用花藥涂抹開花當天的雌能花柱頭，直到可以明顯看到柱頭上黃色的花粉為止，之后套袋。授粉后15 d（5月23日），第1次生理落果期結束，結果枝上的果實分為2種（圖2），一種是子房略微膨大的未成功受精果實，另一種是子房明顯膨大的受精成功果實[16，18]。5月23日，統計受精率（子房明顯膨大果實數/授粉花朵數×100%）；7月19日（即果實采收前），統計最終坐果率（成熟果實/授粉花朵數×100%），并采收各授粉組合果實，進行產量及種實性狀測定。

圖2 授粉15 d后文冠果果實發育情況Figure 2 Fruit development of X.sorbifolium after 15 days of pollination

1.2.5 產量及種實性狀測定 果實成熟后（2018年7月19日），按授粉組合采集所有雜交果實，記錄果實個數、每果種子數，電子天平稱量單果質量、單果種子質量、百粒重，精確到0.01 g。游標卡尺測量果實橫徑、縱徑（各授粉組合均3次重復，每重復10個果實），種子橫徑、縱徑、側徑（種子最寬處厚度）（3次重復，每重復10粒種子），精確到0.01 mm。隨機選取各授粉組合種子150粒，取種仁，每重復1 g種仁，3次重復，采用索氏提取法測定種仁含油率[19]。

表1 授粉配置設計Table 1 Pollination configuration design

1.3 數據處理方法

計算每百朵雌能花種子產量=每百朵雌能花果實個數×平均每果種子數×平均單籽質量。出籽率=單果種子質量/單果質量×100%。出仁率=種仁質量/種子質量×100%。

采用Excel 2016統計數據并進行相關圖表制作，用SPSS 19.0進行方差分析及主成分分析，用Duncan檢驗進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 各無性系花期相遇情況

由各無性系花期物候和相遇情況（表2）可知：文冠果5個無性系開花集中在4月27日至5月14日，雌能花、雄能花單花花期7 d左右，雌能花花期為14～16 d，盛花期持續6～7 d，雄能花花期為15～17 d，盛花期持續7～9 d。各無性系雌能花和雄能花盛花期相遇情況：10號、16號雌能花與119號雄能花相遇時間為5 d，與其余無性系雄能花相遇時間為6 d；14號雌能花與119號雄能花相遇時間6 d，與其余無性系雄能花相遇時間為7 d；15號雌能花與所有無性系雄能花相遇時間為6 d；119號雌能花與16號雄能花相遇時間6 d，與其余無性系雄能花相遇時間為7 d。從花期相遇情況看，5個無性系雌能花、雄能花盛花期較一致，相遇時間較長。

表2 文冠果5個無性系花期觀測Table 2 Observation of florescence meeting stage of 5 clones of X.sorbifolium

2.2 花期各階段柱頭可授性

根據開花不同天數的雌能花柱頭在聯苯胺-過氧化氫溶液下的反應情況，判斷可授性強弱（表3）。由表3可知：5個無性系柱頭可授性表現一致，雌能花花蕾初開放（-1 d）時可授性較弱，此時柱頭呈綠色，黏液較少（圖1A①）；開花當天（0 d）及花后1 d可授性最強，此時柱頭呈淡黃色，三基瓣外翻，乳突細胞體積較大，并可看到大量發亮的黏液分泌（圖1A②和1A③）；花后2～3 d可授性較強，此時柱頭為暗黃色，乳突細胞體積較大但黏液量較少（圖1A④和1A⑤）；花后4～5 d可授性較弱，此時柱頭開始干枯變黑，基本無黏液分泌（圖1A⑥和1A⑦）。由此可知，文冠果雌能花柱頭對花粉接受能力可持續4～5 d。隨著開花天數增加，可授性逐漸降低，柱頭干枯變黑時，可授性消失。

2.3 不同時期父本花粉活力

由各無性系開花不同時期花粉活力（表4）可知：5個無性系花粉活力均表現出，花蕾初開放（-1 d）和開花當天（0 d）之間無顯著差異，兩者均顯著高于花后1 d的花粉活力?；ɡ俪蹰_放時，5個無性系花粉活力為84.26%～90.25%，此時雄能花呈鐘狀，花瓣基部呈黃綠色，2～3個花絲伸長，花藥散粉（圖1B①）。開花當天5個無性系花粉活力為75.59%～89.12%，此時花瓣平展，花瓣基部為黃色，4～6個花絲伸長，花藥散粉（圖1B②）。花后1 d各無性系花粉活力最低，為7.91%～15.13%，此時花瓣基部變為淺橙黃色，花絲全部伸長，所有花藥均已散粉（圖1B③）。文冠果雄能花散粉極快，花后2 d花瓣基部由橙黃逐漸變為紫紅，此時已全部散粉（圖1B④和圖1B⑤）。

表3 文冠果5個無性系開花不同時期柱頭可授性Table 3 Stigma receptivity of 5 clones of X.sorbifolium in different flowering stages

表4 文冠果5個無性系開花不同時期花粉活力對比Table 4 Comparison of pollen vitality of 5 clones of X.sorbifolium in different flowering stages

2.4 各授粉組合受精及坐果情況

各授粉組合的受精率和最終坐果情況（圖3）表明：以10號無性系為母本（圖3A），10×16受精率顯著高于其他授粉組合，10×16、10×119和10×15顯著提高了10號無性系最終坐果率，與10ck相比，分別提高467.48%、328.83%和206.74%。由圖3B可知：人工授粉可以顯著提高14號無性系的受精率和最終坐果率；與14ck相比，14×16對母本受精率提高最為顯著，14×15對母本最終坐果率提高最為顯著。以15號無性系為母本（圖3C），僅15×10、15×MP和15×16提高了母本的受精率和最終坐果率；15×14和15×119最終坐果率為0和1.05%，說明14號、119號無性系不適合做15號授粉樹。以16號無性系為母本（圖3D），與16ck相比，僅16×15顯著提高了母本受精率。16×MP組合受精率為0。最終坐果率最高的是 16ck（7.38%）， 其次是 16×15（5.45%）和 16×14（4.00%）。 119號無性系為母本（圖 3E）時，各授粉組合受精率為0～3.64%，119×MP對母本最終坐果率提高最為顯著，119ck、119×10、119×15最終坐果率均為0。因此，10號、14號、15號、16號無性系均不適合做119號無性系授粉樹。

2.5 不同授粉組合對種子產量的影響

對各無性系自然授粉、混合授粉和交互授粉中受精率、最終坐果率排名前3位的授粉組合子代果實進行產量計算和種實性狀測定，為便于比較，將種子產量轉換成每百朵雌能花種子產量。因10×MP、16×MP、15×119和119號無性系全部授粉組合最終結果個數為0～4，樣本數量小，故未進行產量計算和種實性狀測定。

由不同授粉組合對種子產量的影響（圖4）可知：10號無性系為母本時，10ck產量最低（24.92 g），10×16產量最高（198.02 g），是10ck的7.95倍。以14號無性系為母本，產量從高到低依次為14×15、14×MP、14×10、14×16、14ck，分別是14ck產量的20.44、18.97、12.05和11.36倍。以15號無性系為母本，15×MP、15×10和15×16產量顯著高于15ck產量。以16號無性系為母本，產量最高的是16×15（110.82 g），是16ck（27.31 g）的4.05倍?？梢?，人工授粉可以有效提高文冠果種子產量。

2.6 不同授粉組合對種實性狀的影響

圖3 文冠果5個無性系受精率和最終坐果情況Figure 3 Fertilization rate and final fruit setting rate of 5 clones of X.sorbifolium

圖4 不同授粉組合對文冠果種子產量的影響Figure 4 Effect of different pollination combinations on seed yield of X.sorbifolium

表5為各授粉組合對種實性狀的影響（同2.5，僅對計算產量的授粉組合進行統計）。10號無性系作母本，10×16在每果種子數、百粒重和種仁含油率方面均最高，10×15在果實大小及出仁率方面表現較優。以14號為母本，14×16在出籽率、百粒重和出仁率較高方面優于其他授粉組合，14×MP果實橫徑、縱徑、百粒重較小，但每果種子數最多（18.30粒）。人工授粉顯著提高了15號為母本的各授粉組合的出籽率。15×MP出籽率最高（53.86%），15×10組合出仁率最高（58.20%），15×16每果種子數最高（20.36粒）。以16號為母本，各授粉組合顯著增加了16號果實縱徑。16×15的出籽率、百粒重、種仁含油率均最大。

2.7 各授粉組合綜合評價

對受精率、最終坐果率、產量及表5中的種實性狀指標，共14個指標進行主成分分析，得到各主成分的特征向量、特征值、貢獻率及累計貢獻率（表6）。其中，前4個主成分累計貢獻率達81.21%，能夠有效代表各授粉組合種實性狀的主要信息。其中F1代表百粒重、種子縱徑、種子側徑，歸為種子表型及質量；F2主要反映受精率、最終坐果率及產量，歸為親和性及產量因子；F3代表出仁率；F4代表出籽率。

表5 不同授粉組合對種實性狀的影響Table 5 Effect of different pollination combinations on fruit and seed characters

根據因子得分的系數矩陣和方差奉獻率，得到各主成分以及綜合評價函數表達式：

表6 5個主成分的特征向量、特征值、貢獻率及累計貢獻率Table 6 Eigenvector,eigenvalue,variance contribution and cumulative contribution of 5 principal components

同時，分別以F1、F2、F3、F4對應的方差貢獻率作為權數，得到各授粉組合種實性狀綜合得分。由表7可知：以10號無性系為母本，10ck的F1值最高，說明自然授粉種子表型及質量較大。10×16的F2值最高，說明該組合父本母本親和性較強，提高母本產量幅度最高。總得分最高的是10×119（34.112），其次為10×16（33.577）。以14號無性系為母本，14ck的F1值最高，說明自然授粉種子表型及質量較大。親和性及產量因子和總得分均以14×15最高。15號無性系為母本時，10ck的F1值最高，說明自然授粉種子表型及質量較大。15×16的F4值及總得分最高。以16號無性系為母本，F2值及總得分最高的組合均為16×15。

表7 不同授粉組合綜合得分Table 7 Comprehensive scores of different pollination combinations

3 討論與結論

篩選最佳授粉組合的前提是父本雄能花盛花期與母本雌能花盛花期相遇時間較長，以保證充分授粉受精[20]。本研究中，文冠果5個無性系雌能花、雄能花盛花期相遇時間較長（5～7 d），符合授粉樹配置花期一致要求?；ǚ刍盍χ苯佑绊懝麡涫诜?、受精及坐果[21]。本研究發現：5個文冠果無性系的雄能花初開放及開花當天花粉活力為75.59%～90.25%，即各無性系均適宜作為授粉無性系。柱頭的可授性受花期的長短、開花后的時間以及柱頭分泌物等因素影響[22]。如油茶Camellia oleifera[23]開花1～5 d可授性較強，膏桐Jatropha curcas[24]雌花柱頭花后1～4 d可授性最強。本研究發現：各無性系柱頭可授性在開花當天及花后1 d較強，且持續4～5 d，因此，各無性系可作為授粉母樹。

自交不親和或自交結實率低的樹種，如亞洲李Prunus salicina、富士蘋果Malus domestica‘Fuji’等，可以通過授親和性較強的花粉提高坐果率及產量[25-26]。文冠果自交不親和，自然坐果率較低，只有0.3%～5.1%[27-28]。本研究中，10號、14號、15號和119號無性系自然授粉最終坐果率為0～2.23%，16號無性系自然授粉最終坐果率為7.38%。在花粉活力正常的情況下，不同父本對母本的坐果率影響較大，說明兩者親和力越高，受精率越高，最終坐果率也越高。14×119組合受精率為20.49%，最終坐果率為5.33%，而14×15組合受精率29.43%，最終坐果率為16.14%。由此可見，只有父本、母本親和性強時，才能提高坐果率，這與劉國彬等[29]在板栗 Castanea mollissima上的研究一致。產量方面，10號、14號、15號和16號無性系均表現出自然授粉顯著低于交互授粉中親和性強的各組合產量，如以14號為母本的授粉組合中，各組合最終坐果率均顯著高于14ck最終坐果率，而且，產量是14ck產量的11.36～20.44倍。由此可見，最佳授粉組合篩選可以提高文冠果坐果率及產量。因此，在生產中進行科學的授粉樹配置是提高文冠果坐果率及產量的關鍵。

此外，本研究所選優良無性系均來源于結實率、產量較高的母樹，但119號無性系所有授粉組合坐果情況均較差，這說明樹木的生長結實表現除了受自身遺傳因素影響，還受到環境因素的作用。該無性系原株生長的立地條件、周圍授粉樹的配置與嫁接苗圃里這些因素的差異都會影響到其表現。因此，生產實踐中對所選高產種質資源無性系化推廣時，還應考慮環境因素，即授粉樹的配置對坐果及結實性狀的影響。文冠果成功授粉還受到多方面的影響，因此，今后需要對傳粉媒介、授粉效率及促進措施、授粉最佳氣候條件、授粉后相應的配套管理技術進一步研究。

綜上所述，本研究根據各授粉組合綜合評價認為：以10號無性系為母本，綜合評價總得分最高的是10×119（34.112），但親和性及產量因子得分最高的是10×16（33.577），因此，16號和119號無性系均可作為10號無性系授粉樹。綜合考慮親和性及產量因子得分和綜合評價總得分，14號、15號和16號無性系的最佳授粉組合分別是14×15，15×16和16×15。