桂花OfFCA基因的克隆及在花芽分化時期的表達分析

吳 琪，吳鴻飛，周敏舒，徐倩霞，楊麗媛，趙宏波，董 彬

（浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州311300）

開花是植物生命周期中的重要發育階段，受自身遺傳和外界環境因素的影響[1]。FCA（FLOWERING LOCUS CA）參與擬南芥Arabidopsis thaliana開花調控，通過多腺苷酸化（polyadenylation）和介導FLC（FLOWERING LOCUS C）染色質的組蛋白去甲基化（demethylation）調控開花[2-4]。擬南芥的fca突變后會抑制開花促進因子 FT（FLOWERING LOCUS T）和SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS）的表達，fca突變體在不同光周期下均表現出晚花表型[5]。另外，FCA可以激活LFY（LEAFY）和AP1（APETALA1）的活性促進擬南芥開花[6]。將水稻 Oryza sativa和巴西橡膠樹 Hevea brasiliensis的FCA基因轉入擬南芥fca突變體，會導致晚花性狀出現逆轉和恢復[7-8]。由此可見，FCA在植物花期調控方面發揮著重要作用。環境溫度影響植物開花時間。植物FCA基因是溫敏途徑（thermosensory pathway）中的重要基因，可響應溫度變化調控植物的花芽分化[9]。與16℃相比，23℃可促進擬南芥FCA的轉錄，使FCA蛋白水平升高，fca突變體對溫度不敏感[10]。FCA通過誘導FT表達在高溫下促進擬南芥開花[11]。與1年生擬南芥相比，一些多年生植物對溫度變化的反應及其對開花的影響表現出多樣性。例如，在多年生擬南芥的1個祖先近源種Boechera stricta中，與18℃相比，25℃處理下開花延遲[12]；同樣，在菊花Chrysanthemum morifolium中，也發現夏季溫度升高能延遲菊花開花[13]。目前，對環境溫度調控其開花的機理主要集中于模式植物中，木本植物種類繁多，且開花差異很大，關于木本植物中如何響應環境溫度變化調控開花的機理仍不清楚。本研究通過對桂花Osmanthus fragrans OfFCA基因的同源克隆和定量聚合酶鏈式反應（PCR），分析OfFCA在不同溫度下桂花不同花芽分化時期不同組織中的表達情況，初步探究OfFCA參與桂花花芽分化的調控作用，為桂花的花期調控、遺傳改良以及新品種培育提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

從浙江農林大學桂花種質資源圃中，選取株齡相同且生長一致的桂花‘堰虹桂’O.fragtans‘Yanhonggui’，分別于19和25℃處理。當處理0、10、20、30、40、50和60 d時，分別采集‘堰虹桂’的葉和花芽，一部分進行顯微解剖結構觀察；另一部分液氮處理后-80℃凍存，用于基因克隆和定量PCR分析。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片制作 石蠟切片制作參照劉濤等[14]的方法。主要步驟包括：①固定。采用體積比為18∶1∶1的700 mL·L-1乙醇、冰乙酸和甲醛將不同時期桂花的樣品固定24 h以上。②切片。將經過脫水、透明、滲蠟、包埋等處理材料進行切片，厚度約12 μm。③染色及觀察。固綠染色后用中性樹脂封片，風干后，于顯微鏡（Axio Imager 2，日本）下觀察。

1.2.2 RNA提取及反轉錄 取花芽分化時期約0.5 g的花芽或葉片，按照RNAprep pure Plant Kit試劑盒說明書提取RNA，RNase-free DNaseⅠ（Takara）去除DNA。cDNA反轉錄參照Reverse Transcriptase MMLV（Takara，大連）說明書，產物儲存于-20℃備用。

1.2.3 桂花OfFCA基因的克隆 通過前期轉錄組獲得的FCA基因Unigene片段設計特異性引物（FCA-F：GCTATTCGTTGGAGGAGTT；FCA-R：GTTGTCTTGCGTAGTTGTC），以反轉錄的cDNA為模板進行PCR擴增， PCR 反應體系如下： 上下游定量引物（10 μmol·L-1）各 1 μL， cDNA 1 μL， 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）10 μL和雙蒸水7 μL。PCR反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min；35次循環；72℃延伸10 min；4℃保存備用。PCR反應產物經10 mg·g-1瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，純化，連接到pMD18-T載體，轉化大腸埃希菌Escherichia coli DH5α感受態細胞，藍白斑篩選陽性克隆，經PCR鑒定后送上海生工生物科技公司測序。

1.2.4 桂花OfFCA基因及其編碼蛋白的生物信息學分析 將克隆得到的OfFCA基因用DNAMAN軟件進行多重比對序列，使用MEGA 7.0軟件Neighbor-Joining法構建系統發育樹；利用MultiLoc 2軟件（http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/MultiLoc2）進行亞細胞定位預測；在線工具TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和 SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析 OfFCA 蛋白跨膜結構域、信號肽預測；利用ExPASy工具中的SOPMA軟件預測蛋白質二級結構，用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）對三級結構進行預測。

1.2.5 實時熒光定量PCR 設計OfFCA熒光定量引物，送上海生工生物科技公司合成。熒光定量PCR反應體系為：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10.0 μL，上下游定量引物（OfFCA-F：AGCATGTGTGTCCTGATGGA； OfFCA-R： GCTTATGATGCACCGGTTGT）各 0.8 μL（10 μmol·L-1）， cDNA 2.0 μL， 雙蒸水補齊至20.0 μL。反應程序如下：95℃預變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 15 s。3次生物學重復。采用2-△△CT法[15]計算OfFCA的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 桂花OfFCA基因克隆及序列分析

同源克隆獲得桂花OfFCA基因cDNA序列，長度為1 319 bp（圖1），開放閱讀框為864 bp，編碼287個氨基酸，基因登錄號為MK737873。通過DNAMAN軟件比對發現：OfFCA與旋花科Convolvulaceae矮牽牛Ipomoea nil的IpFCA-like、茄科Solanaceae馬鈴薯Solanum tuberosum的SoFCA-like、胡麻科Pedaliaceae芝麻Sesamum indicum的SeFCA-like及玄參科Scrophulariaceae溝酸漿Erythranthe guttata的EryFCA和煙草Nicotiana attenuata的NiFCA-like較為相似，其氨基酸序相似度分別為76%、69%、68%、68%和68%（圖2）。

2.2 桂花OfFCA編碼蛋白的生物信息學分析

ExPASy軟件結構域預測發現：OfFCA蛋白具有典型的RRM基序和WW結構域（圖2），其相對分子質量為70.6 kD，理論等電點值為5.12。OfFCA蛋白不存在信號肽，亞細胞定位預測顯示：OfFCA蛋白定位于細胞質。蛋白結構三級如圖3所示。親水性指數（GRAVY）為-0.565，表明OfFCA具有較好的親水性。

圖1 桂花OfFCA PCR電泳圖Figure 1 Electrophoretogram of OfFCA gene

圖2 OfFCA與其他物種同源蛋白氨基酸序列比對Figure 2 Comparative analysis of OfFCA protein sequence

2.3 桂花OfFCA系統進化樹分析

用MEGA7.0構建‘堰虹桂’與其他物種FCA之間的系統發育樹（圖4）。結果顯示：OfFCA與木犀科Oleaceae油橄欖Olea europaea的OlFCA和胡麻科芝麻的SeFCA具有較近的親緣關系。

圖3 桂花OfFCA蛋白三級結構預測Figure 3 Tertiary structure prediction for OfFCA protein

圖4 桂花OfFCA系統進化樹Figure 4 Phylogenetic tree based on OfFCA gene

2.4 不同溫度下桂花花芽分化進程及OfFCA表達特性分析

通過對不同溫度下‘堰虹桂’不同花芽分化時期的石蠟切片發現：19℃處理約20 d后，‘堰虹桂’進入花序分化期，約30 d后進入小花分化期，40 d左右進入花萼和花瓣分化期，50 d后進入雄蕊分化期和雌蕊退化分化期。但在25℃處理下，‘堰虹桂’在30 d左右進入花序原基分化期且一直處于該時期（圖5），花芽分化進程顯著延遲。以上現象說明低溫19℃能夠顯著促進‘堰虹桂’的花芽分化進程，從而促進開花時間提前。

圖5 不同溫度處理下‘堰虹桂’花芽分化進程Figure 5 Flower bud differentiation period of Osmanthus fragrans‘Yanhonggui’ under different temperature treatments

FCA基因是植物響應溫度變化調控植物開花的重要基因，對桂花OfFCA基因進行定量表達檢測發現：無論是在葉還是花芽組織中，OfFCA基因在19℃的表達均顯著高于25℃（圖6），這說明OfFCA基因可響應相對低溫19℃的變化，參與調控‘堰虹桂’的花芽分化。

3 討論

圖6 OfFCA基因在‘堰虹桂’葉和花芽中的表達變化Figure 6 Expression pattern of OfFCA in leaf and flower bud at different temperatures

環境溫度不同于春化作用和冷脅迫，一般處于該物種生理學和非脅迫溫度之間，廣泛影響植物的生長發育。不同物種對環境溫度的響應具有很大差異，例如，在低溫條件下，擬南芥和水稻的開花時間均延遲[16-17]，但是在朵麗蝶蘭Doritaenopsis hybrid的研究中，低溫能夠誘導其成花轉變，促進生理生化變化及花芽分化[18]。同時在煙草的研究中，低溫也是促使煙草提前進入花期的重要因素之一[19]。本研究發現：與正常生長溫度25℃相比，相對低溫19℃顯著促進‘堰虹桂’花芽分化進程，使開花時間提前（圖5）。目前，FCA同源基因在擬南芥等多個物種中已克隆得到，但是至今仍沒有桂花OfFCA基因的相關報道。本研究從桂花秋桂品種‘堰虹桂’中分離得到1 319 bp的OfFCA基因（圖1），其開放閱讀框為864 bp，編碼287個氨基酸，基因登錄號為MK737873。與其他物種FCA同源基因類似，OfFCA具有典型的RRM基序和WW結構域，與矮牽牛IpFCA-like的同源性最高（76%），且與其他物種包括馬鈴薯、芝麻、溝酸漿以及煙草的同源性均高達68%以上（圖2）。另外，OfFCA基因與木犀科油橄欖OeFCA和胡麻科芝麻SiFCA關系最近（圖4）。

環境溫度對植物的花芽分化和開花具有重要的影響，其調控機制也存在很大的差異。FCA受轉錄和轉錄后調控，在擬南芥中，與16℃相比，23℃時FCA轉錄和蛋白質水平升高，進而促使成花轉變使花期提前[20]。但在木本植物三葉橙Poncirus trifoliata中，與23℃相比，PtFCA1在較高的環境溫度（27℃）顯著下調，且35S::PtFCA1回補擬南芥fca-1突變體花期顯著提前[21]。在桂花中發現，無論在葉和花芽中，19℃條件下OfFCA基因的表達均顯著高于25℃（圖6）。據此可以推測，OfFCA響應環境溫度變化參與桂花的花芽分化并使開花時間提前。在擬南芥等模式植物中，FCA通過抑制FLC以及SVP（SHORT VEGETATIVE PHASE）基因調控FT和SOC1的表達來促進花芽分化和開花時間[22]，但是桂花OfFCA基因是否像模式植物一樣，通過直接調控FLC和SVP基因的表達進而使FT和SOC1蛋白積累促進開花，還有待更進一步的驗證。

目前，關于桂花的開花分子機制的報道比較少[23]。本研究通過對桂花的FCA基因克隆和表達分析，初步探究OfFCA影響環境溫度變化調控桂花花芽分化的分子機制，對桂花的花期調控、遺傳改良以及新品種培育提供一些理論基礎。