火焰南天竹莖段離體培養再生體系的優化

葉 雯，袁超群，秦 偉，王振濤，朱玉球

（1.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州311300；2.嘉興中瑞生物科技有限公司，浙江 嘉興 314051）

火焰南天竹Nandina domestica‘Firepower’為園藝新品種，植株矮小、株型緊湊，莖節短，只有南天竹N.domestica的1/10，葉片呈卵形或者橢圓形，和南天竹披針形葉存在著明顯的區別[1-4]。當氣溫下降到5℃以下且晝夜溫差超過10℃時，葉片呈火紅色，經霜不落，春夏季呈淡綠色，極具觀賞價值與經濟價值，市場需求量大[1-2]。常采用扦插繁殖，繁殖周期較長，繁殖率極低，并且扦插容易感染病毒，造成品質退化。已有報道利用組織培養技術解決火焰南天竹繁殖數量少、繁殖速度慢、種質易退化等缺點[3-10]，雖然能夠通過愈傷組織、莖尖和葉片等作為外植體獲得不定芽，但增殖系數相對較低[6,11]。有些雖然能夠大規模生產，培養基配方中使用蔗糖[12]，成本較高，距規模化、產業化生產還有一定的差距。鑒于此，本研究以火焰南天竹不帶葉莖段為外植體，進行離體快繁影響關鍵因子優化，建立適合大規模生產的火焰南天竹莖段離體快速繁殖技術體系，旨在為火焰南天竹種苗高效、快捷和穩定生產提供技術和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

火焰南天竹由嘉興中瑞生物科技有限公司提供。選擇生長健壯、無病蟲害的火焰南天竹優良單株的嫩枝條為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 火焰南天竹芽生長基本培養基篩選 以1/2MS、WPM、DCR、B5為基本培養基，分別添加6-芐基腺嘌呤（6-BA）0.50 mg·L-1，萘乙酸（NAA）0.20 mg·L-1， 蔗糖 30.0 g·L-1，卡拉膠 7.0 g·L-1（pH 5.8），進行芽生長基本培養基篩選。選取長0.5～1.0 cm帶節莖段，保持極性，接種于不同篩選培養基上，接種莖段10個·瓶-1，每種培養基接種10瓶，于1 500～3 000 lx光照，（25±2）℃培養40 d后，觀察和統計芽誘導、增殖和生長情況。

1.2.2 不同質量濃度6-BA和NAA配比對火焰南天竹芽誘導和增殖的影響 選取1.2.1篩選的理想基本培養基， 添加不同質量濃度 6-BA（0、0.25、 0.50、0.75、 1.00 mg·L-1）和 NAA（0.10、0.50 mg·L-1）組成 10種不同配方培養基，以初代培養獲得無菌芽苗為試材，剪取帶節的莖段，接種在培養基上，接種莖段10個·瓶-1，培養條件同1.2.1。培養40 d后，統計芽誘導、增殖情況。

1.2.3 火焰南天竹幼苗的生根培養 ①生根基本培養基的篩選。選取約3 cm高的無菌芽苗，分別接種在添加 0.25 mg·L-1IBA+0.25 mg·L-1NAA+30.0 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉膠（pH 5.8）的 1/2MS 和 1/2WPM基本培養基上。接種芽苗10株·瓶-1，每種培養基接10瓶。②生根最佳NAA質量濃度的篩選。選取約3 cm高的芽苗分別接種在添加不同質量濃度（0.10、 0.30、 0.50 mg·L-1）NAA， 30.0 g·L-1蔗糖， 7.0 g·L-1卡拉膠（pH 5.8）的生根理想基本培養基上，接種芽苗10株·瓶-1，每種培養基接10瓶。③生根白砂糖質量濃度的篩選。蔗糖是組織培養中最好的碳源，但種苗規模化生產過程中，降低成本是很有必要的，為此研究白砂糖不同質量濃度對火焰南天竹生根的影響。選取約3 cm高的芽苗，分別接種于20.0、30.0、40.0 g·L-1白砂糖的生根培養基（pH 5.8）上，以30.0 g·L-1蔗糖為對照。接種芽苗10株·瓶-1，每種培養基接10瓶。④試管苗生長的最佳pH值篩選。將約3 cm高的芽苗分別接種于不同pH值（5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4、8.8、9.2）的生根培養基上，接種芽苗10株·瓶-1， 每種培養基接10瓶。以上篩選試驗培養條件同1.2.1，培養30 d后，統計生根率。

1.2.4 培養條件的篩選 將0.5～1.0 cm長帶節火焰南天竹莖段接種在前期篩選的芽誘導、增殖和生根的最佳培養基上，接種后分別暗培養0、5、15 d后，于1 500～3 000 lx光照，時間12 h·d-1，（25±2）℃下進行芽誘導、芽增殖、生根培養等試驗，每處理接種10瓶，外植體10個·瓶-1，統計其生長情況，篩選出各培養階段的合適條件。

1.2.5 數據統計與分析 采用Excell和SPSS 17.0對所得數據進行統計分析和作圖。芽誘導率、生根率和芽增殖系數計算公式如下：芽誘導率=出芽外植體數/接種數×100%；生根率=生根外植體數/接種數×100%；芽增殖系數=外植體誘導芽數/外植體接種數。

2 結果與分析

2.1 基本培養基對火焰南天竹芽生長的影響

由表1可知：基本培養基對火焰南天竹芽誘導有明顯的影響。DCR對火焰南天竹的芽誘導效果最好，出芽率高達96.8%；其次是WPM和1/2MS，芽誘導率分別為90.2%和85.0%，而B5的芽誘導率只有43.2%。因此，選擇DCR火焰南天竹莖段芽誘導較理想的基本培養基。培養40 d后，在WPM上，芽的增殖倍數和芽高分別為3.18和1.18 cm，植株生長健壯，葉色綠色，葉片舒展寬大；在DCR上芽增殖倍數為2.05，芽高0.95 cm，植株生長正常，葉色綠色，但葉小卷曲。而在1/2MS和B5培養基上，芽的增殖位數僅為1.52和1.06。4種基本培養基無機鹽質量濃度從高到低依次為B5、1/2MS、DCR、WPM，因此，可以推斷低質量濃度無機鹽有利于火焰南天竹芽誘導、繁殖和生長。因此，綜合芽誘導、增殖和植株生長情況等，選擇WPM為本試驗的理想基本培養基。

表1 基本培養基對火焰南天竹出芽的影響Table 1 Effect of basic media on rooting of N.domestica‘Firepower’

2.2 6-BA和NAA對火焰南天竹芽誘導與芽增殖的影響

由圖1可見：6-BA和NAA的質量濃度對芽的誘導和增殖影響差異極顯著（P=0.000 1）。當NAA質量濃度一定時，隨著6-BA質量濃度的增加，火焰南天竹的出芽率及芽的增殖倍數呈上升趨勢，當6-BA達1.00 mg·L-1時，出芽率及芽的增殖倍數達最高值，但芽生長緩慢，葉小，葉片皺褶卷曲，新生幼葉脆弱，易玻璃化，不利于芽苗的生長。綜合分析表明：芽誘導理想培養基為WPM+0.50 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA，芽誘導率高達93.0%；芽增殖的理想培養基為WPM+0.75 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA，芽增殖倍數為3.3，新芽生長良好，葉片舒展寬大，葉色鮮綠（圖2A）。方差分析可知：6-BA和NAA兩者互作的差異不顯著（P=0.998 1）。

2.3 火焰南天竹試管苗生根條件的篩選

2.3.1 基本培養基對火焰南天竹試管苗生根的影響 由表2可見：基本培養基對火焰南天竹試管苗生根有一定的影響，火焰南天竹在WPM上的生根優于1/2MS培養基，在WPM上的生根率、平均根數分別是1/2MS的3.1和2.6倍，且試管苗生長良好，葉片舒展、鮮綠色。因此，低質量濃度無機鹽的WPM培養基有利于試管苗生根和生長。

2.3.2 NAA對火焰南天竹試管苗生根的影響 由表3可知：NAA質量濃度對火焰南天竹芽苗生根影響明顯，隨著NAA質量濃度的增加，試管苗的生根率、平均生根數有明顯增加，但對根長的生長影響不明顯。當NAA質量濃度達0.50 mg·L-1時，試管苗生根率高達91.0%，平均根數為5.4根，試管苗生長正常。

圖1 不同培養基組合對火焰南天竹不定芽誘導率和芽增殖倍數的影響Figure 1 Effects of different media combinations on adventitious bud induction rate and bud proliferation times of N.domestica‘Firepower’

表2 基本培養基對火焰南天竹生根的影響Table 2 Effect of basic media on rooting of N.domestica‘Firepower’

表3 NAA對火焰南天竹生根的影響Table 3 Effect of NAA on rooting of N.domestica‘Firepower’

2.3.3 白砂糖濃度對火焰南天竹生根的影響 由表4可知：添加白砂糖30.0 mg·L-1的培養基中火焰南天竹的生根率可達90.4%，平均根數達5.1且植株正常，生長較好，葉片綠色（圖2B和2C），與添加蔗糖30.0 mg·L-1的培養基中的生根差異不顯著。綜合成本和生根情況考慮，大規模種苗生產過程中，可用相同質量濃度的白砂糖替代蔗糖作為碳源。

表4 白砂糖質量濃度對火焰南天竹生根的影響Table 4 Effect of sugar on rooting of N.domestica‘Firepower’

2.3.4 pH值對火焰南天竹生根的影響 由表5可見：pH為6.0時，生根率達95.0%，平均生根數和根長分別為6.1根和1.07 cm，好于其他pH的生根情況。當pH≥6.2時，火焰南天竹生根的各項指標明顯下降，致使植株瘦弱，生長緩慢甚至停止生長。因此，火焰南天竹生根培養基的最佳pH為6.0。

表5 pH值對火焰南天竹生根的影響Table 5 Effect of pH value on rooting of N.domestica‘Firepower’

2.4 培養條件對芽誘導、增殖和生根的影響

在火焰南天竹的組培過程中器官的形成所需培養條件不同，接種后暗培養5 d后轉為光照培養有利于芽的誘導和增殖；生根培養條件為接種后在光強1 500～3 000 lx，光照時間12 h·d-1，溫度為（25±2）℃ 條件下培養（表6）。

表6 培養條件對芽誘導、增殖和生根的影響Table 6 Effect of culture conditions on rooting of N.domestica‘Firepower’

圖2 火焰南天竹不定芽誘導、增殖和生根培養Figure 2 Adventitious bud induction,proliferation and rooting culture of N.domestica‘Firepower’

3 結論

節間較短，枝條細弱，株形矮小，枝條數量有限，這些制約了火焰南天竹的分株和扦插繁殖，使火焰南天竹不能滿足市場的需求[11-12]。為了擴大火焰南天竹的繁殖率，近年來植物組織培養技術已應用于火焰南天竹的繁殖，一定程度打破火焰南天竹自然繁殖力低的限制，加快繁育速度，但在生長過程中發現基因型和環境條件仍然制約著火焰南天竹擴繁。本研究對影響火焰南天竹組織培養再生體系的關鍵因子進行了優化。糖是植物組織培養中提供培養物所需要的碳骨架和能源，是維持培養基穩定的滲透壓不可缺少的碳源物質。本研究發現：30.0 mg·L-1白砂糖和蔗糖分別作為碳源的培養效果差異不顯著，因此考慮到成本問題，規模化生產火焰南天竹時可用白砂糖代替蔗糖。火焰南天竹試管苗生根培養基適宜的pH為5.8～6.0，尤以pH為6.0時生長良好，與李慧[8]研究結果基本一致，同鄧玉營等[9]的研究結果稍有出入，可能是由于所用火焰南天竹的基因型不一致所導致。

本研究以火焰南天竹莖段為材料，優化了火焰南天竹的組織培養再生體系的影響因素，優化的體系為：不定芽誘導理想培養基為WPM+0.50 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA，不定芽增殖培養基為WPM+0.75 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA， 生根培養基為 1/2WPM+0.50 mg·L-1NAA+白砂糖 30.0 g·L-1，pH 6.0。